新冠疫情暴發(fā)以來，其傳播過程中的中間宿主動物始終撲朔迷離。來自中國的研究團隊對多種動物進行了病毒靶細(xì)胞的大規(guī)模單細(xì)胞篩選，進而形成了病毒靶細(xì)胞的綜合圖譜。研究人員針對寵物、牲畜、家禽和野生生物中的11種代表性物種構(gòu)建了單細(xì)胞地圖譜。值得注意的是，他們發(fā)現(xiàn)貓中SARS-CoV-2靶細(xì)胞的比例明顯高于被調(diào)查的其他物種。

此外，研究人員在多種家豬細(xì)胞中檢測到SARS-CoV-2靶細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)意味著在當(dāng)前COVID-19大流行期間，有必要仔細(xì)評估貓傳播新冠的風(fēng)險，并保持對豬的監(jiān)視，以防止其在以后的冠狀病毒暴發(fā)中成為中間宿主。

以上發(fā)現(xiàn)來自深圳華大基因研究院等多單位合作在生物預(yù)印本平臺bioRxiv上的論文“Single-cell screening of SARS-CoV-2 target cells in pets, livestock, poultry and wildlife ”。

該論文的作者團隊中多為基因?qū)W、獸醫(yī)學(xué)及流行病學(xué)專家，通訊作者為華大集團首席執(zhí)行官、國家基因庫執(zhí)行主任、華大基因研究院院長徐訊，農(nóng)業(yè)基因組學(xué)國家重點實驗室主任副主任劉歡，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長、國家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險評估實驗室主任劉雅紅教授等人。

評估研究新冠病毒動物宿主的易感性對于控制傳染病至關(guān)重要。研究人員表示，近期的幾項研究將穿山甲、貓、狗和倉鼠與SARS-CoV-2的感染和傳播聯(lián)系起來，表明病毒可能在動物中普遍流行，這將對人類構(gòu)成潛在威脅。

通常情況下，對于宿主動物的易感性推定通過體內(nèi)試驗或接種實驗進行，但研究人員指出，這些方法存在滿足條件的實驗室和人員有限、檢測的病毒種類和動物數(shù)量有限等問題，而根據(jù)病毒進入宿主的機制確定SARS-CoV-2的靶細(xì)胞則可縮小假定的中間宿主范圍，更加快速準(zhǔn)確地確認(rèn)動物宿主的易感性。

SARS-CoV-2進入宿主細(xì)胞是通過病毒刺突糖蛋白（S蛋白）與細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結(jié)合，以及跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）裂解S蛋白而啟動的。先前的研究表明，動物組織在細(xì)胞組成和基因圖譜方面表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，而ACE2僅在一小部分特定的細(xì)胞群體中表達，這使得針對SARS-CoV-2目標(biāo)細(xì)胞的單細(xì)胞分析成為本次研究的重點。

研究人員構(gòu)建了用于牲畜、家禽、寵物和野生動物的單細(xì)胞圖譜，篩選了144種病毒的受體表達模式，并系統(tǒng)地評估了它們的敏感性。

貓、穿山甲和豬不同器官中SARS-CoV-2靶細(xì)胞的篩選

穿山甲和貓都被懷疑是SARS-CoV-2中間宿主。

此前的研究已經(jīng)從穿山甲中分離出了類似新冠病毒的冠狀病毒，并且有研究提出，SARS-CoV-2是起源于穿山甲冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒的重組；貓也是可疑的中間宿主，因為據(jù)此前的報道新冠病毒存在人對貓和貓對貓的傳播；家豬是與人緊密接觸的動物，此前也有報道稱其對新冠病毒敏感。

因此，研究人員針對這三種新冠易感動物的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、大腸等組織創(chuàng)建了高質(zhì)量且全面的單細(xì)胞圖譜，分別獲得了貓、穿山甲和豬的99740、35345和92863個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

研究人員在貓的肺、眼瞼、食道（免疫細(xì)胞）和直腸（腸內(nèi)細(xì)胞）中檢測到了ACE2和TMPRSS2共同表達細(xì)胞。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)超過40%的ACE2和TMPRSS2共同表達發(fā)生在貓腎近端小管細(xì)胞中，約30％的共同表達則發(fā)生在貓眼瞼上皮細(xì)胞中。

在穿山甲中，研究人員發(fā)現(xiàn)新冠病毒靶細(xì)胞存在于肺內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟（內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和近端小管細(xì)胞）、肝臟（肝細(xì)胞）和脾臟（免疫細(xì)胞）中。

在豬體內(nèi)，ACE2和TMPRSS2主要在肺和腎臟中共同表達。

值得注意的是，研究人員表明，總體而言，貓體內(nèi)新冠病毒靶細(xì)胞的比例遠高于穿山甲和豬體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞類型的比例。

牲畜、家禽、寵物和野生動物肺細(xì)胞中SARS-CoV-2靶細(xì)胞的篩選

肺是新冠病毒供給的主要靶器官之一，肺炎也是新冠病毒感染的典型癥狀。為了評估各種物種的肺細(xì)胞中ACE2和TMPRSS2的詳細(xì)表達模式，研究人員進一步生成了家畜（豬、山羊），家禽（雞、鴿子、鵝、鴨），寵物（貓、狗、倉鼠、蜥蜴），野生動物（穿山甲）的細(xì)胞單核庫，共獲得了123445個細(xì)胞。

研究人員表明，與此前的報道一致，SARS-CoV-2在雞和鴨中的復(fù)制較差，在家禽（雞、鴨、鵝和鴿子）的肺細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2靶細(xì)胞。

在研究人員調(diào)查的貓的11種細(xì)胞類型中，有8種檢測到了SARS-CoV-2靶細(xì)胞，其中存在最多新冠病毒靶細(xì)胞的兩種細(xì)胞是纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。

在豬體內(nèi)，11種細(xì)胞類型中的7種中能夠觀察到ACE2和TMPRSS2的共同表達。

在穿山甲中，研究人員發(fā)現(xiàn)一小部分內(nèi)皮細(xì)胞能夠共同表達ACE2和TMPRSS2。

在倉鼠中，纖毛細(xì)胞是SARS-CoV-2靶細(xì)胞最多的細(xì)胞類型。

在山羊中，研究人員檢測到ACE2和TMPRSS2在AT1受體（血管緊張素1型受體）、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和T細(xì)胞中的共同表達。研究人員表明，山羊與豬和人具有高度相似的ACE2氨基酸序列，這表明山羊ACE2也可能具有相似的介導(dǎo)病毒進入宿主細(xì)胞的能力。

在蜥蜴體內(nèi)，研究人員檢測到的ACE2和TMPRSS2的共表達主要發(fā)生在B細(xì)胞中。而在狗的體內(nèi)，僅有少于0.5％的ACE2和TMPRSS2共表達細(xì)胞存在于纖毛細(xì)胞和AT2受體（血管緊張素2型受體）中。

為了揭示其他呼吸道病毒的假定肺靶向細(xì)胞，研究人員篩選了32種病毒受體的表達模式，以分析來自12個病毒家族的總共29種病毒。

通常，家禽的肺細(xì)胞比哺乳動物和爬行動物表達更少類型的病毒受體。例如，人冠狀病毒229E的受體ANPEP除了在雞和鴨肺細(xì)胞中表達以外，通常不在家禽肺細(xì)胞中表達；SARS（嚴(yán)重急性呼吸綜合征）的受體CLEC4G在山羊肺細(xì)胞中表達，但在家禽的肺細(xì)胞中卻不存在。

此外，大多數(shù)腺病毒科病毒受體在哺乳動物中優(yōu)先表達，鼻病毒C受體在人、貓、狗、倉鼠、豬、山羊和鵝的纖毛細(xì)胞中優(yōu)先表達，而呼吸道合胞病毒受體CD209僅存在于人巨噬細(xì)胞中。

綜上所述，研究人員表示，他們的研究工作首次揭示了不同動物肺中假定的呼吸道病毒靶細(xì)胞，這為在單細(xì)胞水平上剖析呼吸系統(tǒng)病毒的感染和傳播奠定了基礎(chǔ)。

貓和豬有更多新冠易感細(xì)胞類型，家禽中沒有表達

在比較SARS-CoV-2靶向不同物種肺細(xì)胞的頻率時，研究人員注意到貓的纖毛細(xì)胞明顯高過其他物種，其被靶向的頻率約為13.19％，而豬纖毛細(xì)胞僅為3.35％，倉鼠為3.87％。

此外，研究人員在比較貓、穿山甲和豬之間不同器官中SARS-CoV-2靶細(xì)胞的比例時也進一步發(fā)現(xiàn)，ACE2和TMPRSS2靶細(xì)胞在貓中的比例要高得多。例如，在貓的腎近端小管細(xì)胞中，ACE2和TMPRSS2共表達細(xì)胞的比例高達40％，而穿山甲和豬相應(yīng)細(xì)胞類型的比例分別僅為3％和2％左右。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2靶細(xì)胞廣泛分布在貓的消化系統(tǒng)（食道、直腸）、呼吸系統(tǒng)（肺）和泌尿系統(tǒng)（腎臟）內(nèi)的各個器官之間，這表明貓可能會通過多種途徑感染新冠，例如通過飲食感染或通過呼吸系統(tǒng)的空氣傳播被感染。

為了突出顯示SARS-CoV-2易感細(xì)胞類型，研究人員總結(jié)了ACE2和TMPRSS2共表達細(xì)胞比例高于1％的所有細(xì)胞類型，這能夠清楚表明，貓和豬比其他物種具有更多的易感細(xì)胞類型。

研究人員表明，以上數(shù)據(jù)說明貓對新冠病毒具有高度易感性，此外，作為伴侶動物，貓與人類的互動顯然比穿山甲等更加頻繁，因此，研究人員建議在當(dāng)前的新冠大流行中密切監(jiān)視貓，對貓作為新冠中間宿主的可能性進行仔細(xì)評估。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，新冠病毒在狗、雞和鴨中的復(fù)制能力很差，但在山羊和蜥蜴肺細(xì)胞中檢測到了ACE2和TMPRSS2的共表達。

研究數(shù)據(jù)表明，ACE2和TMPRSS2的共表達在狗的肺細(xì)胞中非常罕見，而在家禽的肺細(xì)胞（雞、鴨、鵝和鴿子）中則沒有共表達。

此外，SARS-CoV-2的S蛋白不能有效地利用狗和禽類的ACE2，這是因為部分關(guān)鍵氨基酸發(fā)生了突變。

此前有研究表明，豬ACE2能夠協(xié)助新冠病毒進入HeLa細(xì)胞，并且研究人員發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2靶細(xì)胞分布在家豬的腎臟和肺部的多種細(xì)胞中，同時此前有過SARS病毒人傳豬的報道，因此研究人員認(rèn)為家豬成為SARS-CoV-2中間宿主的可能性仍需要進一步監(jiān)測和評估。

值得注意的是，在之前的實驗中，鼻內(nèi)接種SARS-CoV-2后第2天、第4天和第6天，豬的病毒RNA和抗體測試均呈陰性。研究人員認(rèn)為應(yīng)謹(jǐn)慎對待豬在未來冠狀病毒爆發(fā)中的潛在作用，并進行進一步研究。

“病毒進入的紅綠燈”系統(tǒng)

在研究不同動物體內(nèi)新冠靶向細(xì)胞情況的同時，為了研究宿主細(xì)胞對不同種類病毒的敏感性，研究人員還篩選了144種病毒（代表26個病毒家族）的114種受體在貓、穿山甲和豬的不同器官總以及寵物、牲畜、家禽和野生動物的肺中的表達模式，形成了完整的病毒靶細(xì)胞圖譜。

為了直觀地展示表達病毒受體的細(xì)胞的比例，研究人員提出了一種名為“病毒進入的紅綠燈”系統(tǒng)，用于將每種細(xì)胞類型分配為以下三種狀態(tài)：紅燈、綠燈和黃燈。

簡而言之，如果病毒受體的表達量少于該細(xì)胞類型的1％，則將分配“紅燈”狀態(tài)（指病毒進入的“紅燈”）；如果比例在1％到10％之間，則為“黃燈”狀態(tài)；而如果比例超過10％，則將分配為“綠燈”狀態(tài)。

有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)狂犬病毒受體NCAM1在豬神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞類型中廣泛表達，而在非神經(jīng)組織中很少表達。

此外，該細(xì)胞圖譜還讓研究人員發(fā)現(xiàn)水泡性口炎病毒受體UVRAG在豬肺細(xì)胞中優(yōu)先表達。

研究人員稱，該項目提供了一種可以根據(jù)病毒靶細(xì)胞在不同細(xì)胞群體之間的分布找出易感宿主的新策略，為今后關(guān)于病毒宿主易感性篩選的研究提供了一個新的模型框架，從而甚至可以以無偏見的方式篩查所有現(xiàn)有物種對所有現(xiàn)有病毒的敏感性。

研究人員表示，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展以及國際單細(xì)胞圖譜協(xié)作項目的進展，將能夠以更快的速度生成更多物種的圖譜。