北京時間5月18日晚間，頂級學術期刊《自然-方法學》（Nature Methods）在線發表了來自中國農科院深圳農業基因組研究所、中科院上海生命科學研究院神經科學研究所、中科院計算生物學研究所、上海交通大學、上海科技大學、復旦大學等團隊的一項研究，題為“A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects”。

研究團隊根據蛋白結構預測了基因編輯過程中決定脫靶的重要氨基酸，并在不影響催化活性的情況下突變相應的氨基酸，最終得到了顯著減低基因編輯脫靶效應的單堿基編輯工具。

這篇論文的通訊作者為中國農科院深圳農業基因組研究所研究員、研究組長左二偉，中科院神經科學研究所研究員、靈長類疾病模型研究組組長楊輝，中科院計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學研究所）研究員李亦學。左二偉同時為第一作者。

CRISPR/Cas9是廣泛關注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發明以來備受外界期待。而單堿基編輯技術是CRISPR/Cas9的衍生工具，該技術可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現單核苷酸的定向突變，為治療單堿基突變引起的遺傳性疾病帶來了希望。

目前已知的人類致病遺傳變異中，約58%都屬于點突變，而約15%的致病點突變都屬于T·A--C·G變異。2016年，美國博德研究所、哈佛大學的David Liu的實驗室開發出新型單堿基編輯器CEB（Cytosine Base Editor）。

但從2019年開始，單堿基編輯工具的安全性受到了質疑。楊輝、美國麻省總醫院J. Keith Joung等國內外多個研究團隊此前發文報道了單堿基編輯器存在嚴重的DNA和RNA脫靶效應，該效應可能會引起包括癌癥在內的多種非預期的副作用。與此同時，國內外多位科學家通過多種方式研究降低基因編輯DNA和RNA脫靶的方法，取得了一定進展，但也存在一定局限。

目前最廣泛使用的堿基編輯用的是大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）酶，該酶誘導DNA胞嘧啶（C）脫氨，該系統由連接的Cas蛋白、指導RNA（gRNA）、rAPOBEC1組成。在此次研究中，左二偉、楊輝等人使用研究團隊此前開發的新型脫靶檢測技術GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）和RNA-Seq同時檢測了CEB突變體的DNA脫靶和RNA脫靶。他們同時也發現，DNA和RNA的脫靶是互相獨立的，需要同時檢測。

研究團隊描述了23個合理設計的CBE突變體的篩選，揭示了在預測DNA結合位點上的突變氨基酸可以顯著降低Cas-9脫靶效應。

此外，他們還獲得了一個CBE突變體YE1-BE3-FNLS。研究團隊認為，他們獲得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單堿基編輯工具，顯著降低了脫靶效應并提高了編輯效率，有望應用于遺傳疾病基因治療，推動基因編輯臨床化應用。

據介紹，GOTI是左二偉、楊輝等團隊合作建立的全新一代基因編輯脫靶檢測技術，該技術在靈敏性、準確性和適用范圍上遠超之前的脫靶檢測技術，該研究成果于2019年3月發表于《科學》（Science）。研究團隊隨后基于GOTI深入探索解決單堿基編輯器脫靶效應的方法，此次研究成果是這一系列研究中取得的研究進展之一。

值得一提的是，此前的2月10日，David Liu也在國際學術期刊《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）提出了一種方案。他們篩選不同CBE在大腸桿菌和人細胞中誘導Cas9非依賴的脫氨傾向，找到了降低Cas9非依賴型DNA脫靶風險的關鍵，并通過蛋白質工程等策略構建出一系列低脫靶風險的高活性CBE系統，其中YE1-BE4在保持較高的編輯效率的同時降低了DNA和RNA上的脫靶，并且同時縮小了編輯窗口。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0832-x