4月14日，武漢市衛(wèi)健委啟動(dòng)新冠病毒無(wú)癥狀感染者血清流行病學(xué)調(diào)查，本次調(diào)查采取定點(diǎn)隨機(jī)抽樣的原則，共100個(gè)社區(qū)作為調(diào)查點(diǎn)，抽樣人次總計(jì)約1.1萬(wàn)人。這份血清流調(diào)結(jié)果出來(lái)之前，圍繞新冠患者血清中抗體的討論已越來(lái)越多。

近日，復(fù)旦大學(xué)附屬上海公共衛(wèi)生臨床中心、復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系及醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)室的研究團(tuán)隊(duì)在預(yù)印本網(wǎng)站醫(yī)學(xué)預(yù)印版網(wǎng)站medRxiv上發(fā)表了題為“Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications（新冠肺炎康復(fù)患者隊(duì)列中對(duì)新冠病毒的抗體反應(yīng)及其意義）”的研究論文。該研究尚未經(jīng)同行評(píng)議。

他們的研究結(jié)果顯示，來(lái)自175名康復(fù)患者血清樣本分析發(fā)現(xiàn)，中和抗體（Nabs）在患者發(fā)病后的10-15天達(dá)到峰值，隨后保持穩(wěn)定。有30%的患者產(chǎn)生的中和抗體滴度非常低，其中，有10名康復(fù)患者體內(nèi)的抗體滴度未達(dá)到可檢出的極限值。2例患者的中和抗體滴度非常高，但未出現(xiàn)任何抗體相關(guān)的不良反應(yīng)。

研究團(tuán)隊(duì)指出，這些結(jié)果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能夠在沒(méi)有出現(xiàn)高滴度病毒特異性抗體的情況下康復(fù)。這些患者如何在沒(méi)有中和抗體的幫助下康復(fù)，以及是否存在病情反復(fù)或再感染的較高風(fēng)險(xiǎn)，都有待進(jìn)一步研究。

值得注意的是，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)COVID-19患者的中和抗體滴度還與患者的年齡相關(guān)，中老年患者產(chǎn)生的中和抗體滴度遠(yuǎn)高于年輕患者的抗體滴度。

該研究的通訊作者為復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教授黃競(jìng)荷、復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心副研究員吳凡。黃競(jìng)荷長(zhǎng)期從事艾滋病廣譜中和抗體及流感疫苗的研究，她開(kāi)創(chuàng)性地開(kāi)發(fā)了一種直接從B淋巴細(xì)胞中分離抗體的新技術(shù) （Nature Protocols 2013）。在她此前的研究工作中，已經(jīng)從艾滋病病人體內(nèi)分離到一系列的新型高效廣譜中和抗體10E8、35O22和N6。

此次這項(xiàng)最新研究是第一份關(guān)于從COVID-19康復(fù)患者隊(duì)列的血漿中提取中和抗體的研究報(bào)告，可能為血漿療法等被動(dòng)抗體治療和針對(duì)新冠病毒的疫苗開(kāi)發(fā)提供有用的信息。中和抗體滴度與患者年齡、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液CRP水平的相關(guān)性也為進(jìn)一步探討COVID-19患者中和抗體的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

目前已知的是，中和抗體在病毒清除中起著重要的作用，可用于保護(hù)或治療病毒性疾病。通過(guò)感染或接種疫苗誘導(dǎo)的病毒特異性中和抗體具有阻斷病毒感染的能力。而中和抗體水平也已被用作評(píng)估天花、脊髓灰質(zhì)炎和流感病毒疫苗有效性的金標(biāo)準(zhǔn)。

與此同時(shí)，血漿療法等被動(dòng)抗體治療曾被成功用于治療傳染性病毒性疾病，包括SARS-CoV、流感病毒和埃博拉病毒。被動(dòng)抗體治療的有效性與血漿中中和抗體的濃度或康復(fù)患者中抗體的濃度有關(guān)。COVID-19全球大流行背景下，血漿療法也被認(rèn)為是一種有希望的感染預(yù)防或疾病治療的方法。

然而，研究團(tuán)隊(duì)提到，目前COVID-19患者中新冠病毒特異性中和抗體的水平和作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，他們采用安全、靈敏的基于假病毒-慢病毒載體的中和分析方法，對(duì)來(lái)自上海公共衛(wèi)生臨床中心的175例輕度癥狀康復(fù)患者的血漿進(jìn)行了篩選和測(cè)定。

假病毒（PsV）中和試驗(yàn)是一種靈敏、可重復(fù)的方法，它不會(huì)產(chǎn)生任何高致病性病毒，可以在生物安全二級(jí)設(shè)施中安全處理。該方法此前廣泛用于多種高致病性病毒（包括埃博拉病毒、高致病性流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV）的中和抗體檢測(cè)。

截至2020年2月26日，共有175名COVID-19患者從上海公共衛(wèi)生臨床中心康復(fù)出院。他們的癥狀輕微，沒(méi)有人進(jìn)過(guò)ICU。患者的中位年齡為50歲（16-85歲）；女性患者占比53%。住院時(shí)間中位數(shù)為16天（7-30天），疾病持續(xù)時(shí)間中位數(shù)為21天（9至34天）。

值得注意的是，針對(duì)新冠患者是否會(huì)發(fā)生再感染即“復(fù)陽(yáng)”的現(xiàn)象，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所所長(zhǎng)秦川等人此前在恒河猴身上也提供過(guò)相關(guān)信息，答案比這次黃競(jìng)荷等人的研究相對(duì)樂(lè)觀(guān)。

他們分析，從研究團(tuán)隊(duì)目前對(duì)猴子的縱向研究來(lái)看，如果猴子在初次感染后的早期產(chǎn)生中和抗體，則不會(huì)發(fā)生再感染。這也就意味著，康復(fù)患者在建立了足夠的特異性抗體以產(chǎn)生對(duì)新冠病毒的免疫力時(shí)，就不會(huì)再被傳染。他們認(rèn)為，此前出院患者的‘復(fù)陽(yáng)’不可能是由于再感染所致，需要考慮更復(fù)雜的問(wèn)題來(lái)找出原因。”

新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同

研究團(tuán)隊(duì)收集了5例COVID-19患者出院時(shí)的血漿樣本，測(cè)試了293T/ACE2細(xì)胞對(duì)新冠病毒感染的中和效價(jià)。所有5例血漿均表現(xiàn)出對(duì)293T/ACE2細(xì)胞的新冠病毒PsV感染的濃度依賴(lài)性抑制。高滴度中和抗體的血漿顯示出更高滴度的新冠病毒RBD、S1和S2特異性結(jié)合抗體。

此外，這些患者的血漿也表現(xiàn)出與新冠病毒RBD和S1區(qū)域的交叉結(jié)合，但與SARS-CoV S蛋白的結(jié)合和新冠病毒S蛋白的結(jié)合并不一致。此外，在PsV中和試驗(yàn)中，COVID-19患者血漿不能抑制SARS-CoV感染。

來(lái)自COVID-19患者、顯示出較強(qiáng)的新冠病毒中和活性的26份血漿樣本，既不能中和SARS-CoV PsV感染，也不能抑制VSV-G PsV感染。

這里有一個(gè)前提是，因?yàn)樾鹿诓《竞蚐ARS-CoV之間在S蛋白上氨基酸一致性為77.2%，保守表位可能存在于兩種病毒之間。但這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，盡管COVID-19患者的血漿顯示與SARS-CoV存在交叉結(jié)合，但并沒(méi)有中和SARS-CoV。這就提示，新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同的。

研究團(tuán)隊(duì)提到，本研究推斷的證據(jù)僅表明，在COVID-19感染期間，針對(duì)SARS-CoV和新冠病毒保守表位的交叉中和抗體可能不易被誘導(dǎo)。

患者感染后第10-15天產(chǎn)生中和抗體和結(jié)合抗體

研究團(tuán)隊(duì)監(jiān)測(cè)了疾病進(jìn)程中新冠病毒特異性中和抗體的發(fā)展動(dòng)力學(xué)，對(duì)6例患者發(fā)病后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿進(jìn)行測(cè)定，患者之間中和抗體的發(fā)展動(dòng)力學(xué)相似。所有患者中和抗體的滴度在發(fā)病第10天前較低（ID50: < 200），在發(fā)病第10-15天時(shí)升高達(dá)到峰值，隨后保持穩(wěn)定。

研究人員還測(cè)試了這6例患者血漿中新冠病毒S蛋白（刺突糖蛋白）不同結(jié)合域（RBD、S1和S2）的結(jié)合抗體。中和抗體(右Y軸)和針對(duì)RBD（受體結(jié)合域）、S1和S2的結(jié)合抗體(左Y軸)的動(dòng)力學(xué)一致。

S蛋白是冠狀病毒最重要的表面蛋白，它通常決定病毒的宿主范圍和特異性，是宿主中和抗體的重要位點(diǎn)以及疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此前的研究表明，冠狀病毒通過(guò)S蛋白與受體ACE2結(jié)合，從而介導(dǎo)膜融合和病毒入侵。S蛋白根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)功能又被分為兩個(gè)功能單位，即S1和S2蛋白亞基。

研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了175名康復(fù)患者出院當(dāng)天血漿中新冠病毒特異性中和抗體滴度和S蛋白結(jié)合抗體的水平。他們觀(guān)察到，新冠病毒特異性中和抗體滴度與靶向RBD、S1和S2的S蛋白抗體中度相關(guān)。

他們認(rèn)為，這提示COVID-19患者對(duì)新冠病毒的體液免疫反應(yīng)發(fā)生在感染后第10-15天。除了RBD結(jié)合域外，S2區(qū)域可能是新冠病毒中和抗體的目標(biāo)。

不過(guò)，由于結(jié)合抗體也可能通過(guò)抗體依賴(lài)的吞噬作用或抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用來(lái)清除病毒，因此中和抗體和結(jié)合抗體對(duì)疾病進(jìn)展的影響值得進(jìn)一步綜合評(píng)價(jià)。

總體來(lái)說(shuō)，大多數(shù)COVID-19患者在感染康復(fù)期出現(xiàn)了新冠病毒特異性中和抗體。中和抗體滴度在發(fā)病后10-15天達(dá)到峰值，此后在患者中保持穩(wěn)定。針對(duì)S蛋白不同結(jié)構(gòu)域（包括S1、RBD和S2）的抗體，都可能有助于中和。

大約30%的康復(fù)患者產(chǎn)生非常低滴度的中和抗體

值得注意的是，研究團(tuán)隊(duì)觀(guān)察到，175名康復(fù)患者的血漿中和抗體滴度是存在差異的。ID50s的范圍從低于檢測(cè)限（<40）到21567。大約30%的康復(fù)患者產(chǎn)生一個(gè)非常低水平的中和抗體滴度（ID50: < 500）。不過(guò)，這些患者的病程與其他患者相似。

其中10例患者的中和抗體滴度還在檢測(cè)極限以下（ID50: < 40）。他們認(rèn)為，這表明包括T細(xì)胞或細(xì)胞因子在內(nèi)的其他免疫反應(yīng)可能有助于這些患者的恢復(fù)。

另一方面，2例患者的中和抗體滴度非常高，ID50分別大于15989和21567，但未出現(xiàn)任何抗體相關(guān)的不良反應(yīng)。

總體來(lái)說(shuō)，大約17%、39%、14%的患者分別顯示中低（ID50: 500-999）、中高（ID50: 1000-2500）、高（ID50: > 2500）中和抗體滴度。

研究團(tuán)隊(duì)還收集并測(cè)試了175名患者中47名患者出院后兩周的隨訪(fǎng)檢查中血漿中的中和抗體水平。如圖3C所示，隨訪(fǎng)檢查時(shí)采集的中和抗體血漿滴度與出院時(shí)采集的無(wú)顯著差異。出院時(shí)未產(chǎn)生中和抗體的患者此后也未出現(xiàn)中和抗體。

他們認(rèn)為，這些結(jié)果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能夠在沒(méi)有出現(xiàn)高滴度病毒特異性抗體的情況下康復(fù)。這些患者如何在沒(méi)有中和抗體的幫助下康復(fù)，以及是否存在病情反復(fù)或再感染的較高風(fēng)險(xiǎn)，都有待進(jìn)一步研究。

需要注意的是，在使用恢復(fù)期血漿進(jìn)行預(yù)防或治療之前，在進(jìn)行被動(dòng)抗體治療前，需要對(duì)來(lái)自康復(fù)供體的血漿和血清進(jìn)行滴定，這是有幫助的。研究團(tuán)隊(duì)提醒，這也是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的工作，可以使用PsV中和試驗(yàn)來(lái)完成。

中老年康復(fù)患者出現(xiàn)更高水平的中和抗體

COVID-19患者的中和抗體滴度還與患者的年齡相關(guān)。

研究團(tuán)隊(duì)觀(guān)察到，老年患者比年輕患者更容易誘導(dǎo)更高滴度的中和抗體。如圖4A所示，他們根據(jù)年齡將患者分為三組，分別為年輕人（15-39歲）、中年人（40-59歲）和老年人（60-85歲），每組患者數(shù)量差不多，分別為55例、64例和56例。

中年、老年康復(fù)患者的中和抗體滴度明顯高于年輕康復(fù)患者，對(duì)應(yīng)的中位ID50s分別為1537、1255、488。年齡與中和抗體滴度呈中度正相關(guān)，證實(shí)了年齡在中和抗體產(chǎn)生中的重要作用。中老年康復(fù)患者的RBD、S1和S2靶向抗體明顯高于年輕康復(fù)患者。然而，患者的年齡和住院時(shí)間之間沒(méi)有觀(guān)察到差異。

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這些結(jié)果提示高水平中和抗體對(duì)清除病毒有一定的作用，對(duì)中老年患者的康復(fù)有一定的幫助。

另外，COVID-19康復(fù)患者的年齡和新冠病毒特異性中和抗體與入院時(shí)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與CRP水平呈正相關(guān)。

值得注意的是，目前的研究顯示，年齡是冠狀病毒感染（包括SARS-CoV、MERS-CoV和新冠病毒）后不良疾病預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因素。此前對(duì)感染SARS-CoV的恒河猴的研究則表明，年齡較大的恒河猴會(huì)引起先天免疫應(yīng)答升高，導(dǎo)致比年輕的成年恒河猴呈現(xiàn)更嚴(yán)重的病理反應(yīng)。

在這項(xiàng)研究中，中老年患者入院時(shí)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較年輕患者低，CRP水平較高。不過(guò)，這些患者均未發(fā)展成嚴(yán)重病情，且年齡和住院時(shí)間在這些患者中無(wú)顯著差異。

研究團(tuán)隊(duì)還觀(guān)察到中和抗體滴度與血液淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與血液CRP水平呈正相關(guān)，這表明在細(xì)胞反應(yīng)功能障礙或受損時(shí)，體液反應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。老年患者入院時(shí)血CRP水平較高，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較低，提示先天性免疫應(yīng)答較年輕患者強(qiáng)烈。這些老年患者中，高水平的中和抗體可能是免疫反應(yīng)強(qiáng)烈的結(jié)果。

不過(guò)，高水平的中和抗體是否能保護(hù)這些患者免于進(jìn)展為嚴(yán)重和危重狀態(tài)，值得綜合評(píng)價(jià)。但在這項(xiàng)研究中，嚴(yán)重和危重患者被排除在研究之外，因?yàn)樵谑占瘶颖局八麄円呀邮芰吮粍?dòng)抗體治療。

論文提醒，在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)不能直接評(píng)價(jià)中和抗體對(duì)COVID-19患者病毒清除或疾病進(jìn)展的影響。為解決該問(wèn)題，應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步的全面研究。

論文鏈接：https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.20047365v1