4月14日，武漢市衛(wèi)健委啟動新冠病毒無癥狀感染者血清流行病學調(diào)查，本次調(diào)查采取定點隨機抽樣的原則，共100個社區(qū)作為調(diào)查點，抽樣人次總計約1.1萬人。這份血清流調(diào)結(jié)果出來之前，圍繞新冠患者血清中抗體的討論已越來越多。

近日，復旦大學附屬上海公共衛(wèi)生臨床中心、復旦大學基礎醫(yī)學院病原生物系及醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)生部重點室的研究團隊在預印本網(wǎng)站醫(yī)學預印版網(wǎng)站medRxiv上發(fā)表了題為“Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications（新冠肺炎康復患者隊列中對新冠病毒的抗體反應及其意義）”的研究論文。該研究尚未經(jīng)同行評議。

他們的研究結(jié)果顯示，來自175名康復患者血清樣本分析發(fā)現(xiàn)，中和抗體（Nabs）在患者發(fā)病后的10-15天達到峰值，隨后保持穩(wěn)定。有30%的患者產(chǎn)生的中和抗體滴度非常低，其中，有10名康復患者體內(nèi)的抗體滴度未達到可檢出的極限值。2例患者的中和抗體滴度非常高，但未出現(xiàn)任何抗體相關(guān)的不良反應。

研究團隊指出，這些結(jié)果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能夠在沒有出現(xiàn)高滴度病毒特異性抗體的情況下康復。這些患者如何在沒有中和抗體的幫助下康復，以及是否存在病情反復或再感染的較高風險，都有待進一步研究。

值得注意的是，這項研究發(fā)現(xiàn)COVID-19患者的中和抗體滴度還與患者的年齡相關(guān)，中老年患者產(chǎn)生的中和抗體滴度遠高于年輕患者的抗體滴度。

該研究的通訊作者為復旦大學基礎醫(yī)學院教授黃競荷、復旦大學附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心副研究員吳凡。黃競荷長期從事艾滋病廣譜中和抗體及流感疫苗的研究，她開創(chuàng)性地開發(fā)了一種直接從B淋巴細胞中分離抗體的新技術(shù) （Nature Protocols 2013）。在她此前的研究工作中，已經(jīng)從艾滋病病人體內(nèi)分離到一系列的新型高效廣譜中和抗體10E8、35O22和N6。

此次這項最新研究是第一份關(guān)于從COVID-19康復患者隊列的血漿中提取中和抗體的研究報告，可能為血漿療法等被動抗體治療和針對新冠病毒的疫苗開發(fā)提供有用的信息。中和抗體滴度與患者年齡、淋巴細胞計數(shù)和血液CRP水平的相關(guān)性也為進一步探討COVID-19患者中和抗體的發(fā)生機制奠定了基礎。

目前已知的是，中和抗體在病毒清除中起著重要的作用，可用于保護或治療病毒性疾病。通過感染或接種疫苗誘導的病毒特異性中和抗體具有阻斷病毒感染的能力。而中和抗體水平也已被用作評估天花、脊髓灰質(zhì)炎和流感病毒疫苗有效性的金標準。

與此同時，血漿療法等被動抗體治療曾被成功用于治療傳染性病毒性疾病，包括SARS-CoV、流感病毒和埃博拉病毒。被動抗體治療的有效性與血漿中中和抗體的濃度或康復患者中抗體的濃度有關(guān)。COVID-19全球大流行背景下，血漿療法也被認為是一種有希望的感染預防或疾病治療的方法。

然而，研究團隊提到，目前COVID-19患者中新冠病毒特異性中和抗體的水平和作用尚未見報道。因此，他們采用安全、靈敏的基于假病毒-慢病毒載體的中和分析方法，對來自上海公共衛(wèi)生臨床中心的175例輕度癥狀康復患者的血漿進行了篩選和測定。

假病毒（PsV）中和試驗是一種靈敏、可重復的方法，它不會產(chǎn)生任何高致病性病毒，可以在生物安全二級設施中安全處理。該方法此前廣泛用于多種高致病性病毒（包括埃博拉病毒、高致病性流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV）的中和抗體檢測。

截至2020年2月26日，共有175名COVID-19患者從上海公共衛(wèi)生臨床中心康復出院。他們的癥狀輕微，沒有人進過ICU。患者的中位年齡為50歲（16-85歲）；女性患者占比53%。住院時間中位數(shù)為16天（7-30天），疾病持續(xù)時間中位數(shù)為21天（9至34天）。

值得注意的是，針對新冠患者是否會發(fā)生再感染即“復陽”的現(xiàn)象，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所所長秦川等人此前在恒河猴身上也提供過相關(guān)信息，答案比這次黃競荷等人的研究相對樂觀。

他們分析，從研究團隊目前對猴子的縱向研究來看，如果猴子在初次感染后的早期產(chǎn)生中和抗體，則不會發(fā)生再感染。這也就意味著，康復患者在建立了足夠的特異性抗體以產(chǎn)生對新冠病毒的免疫力時，就不會再被傳染。他們認為，此前出院患者的‘復陽’不可能是由于再感染所致，需要考慮更復雜的問題來找出原因。”

新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同

研究團隊收集了5例COVID-19患者出院時的血漿樣本，測試了293T/ACE2細胞對新冠病毒感染的中和效價。所有5例血漿均表現(xiàn)出對293T/ACE2細胞的新冠病毒PsV感染的濃度依賴性抑制。高滴度中和抗體的血漿顯示出更高滴度的新冠病毒RBD、S1和S2特異性結(jié)合抗體。

此外，這些患者的血漿也表現(xiàn)出與新冠病毒RBD和S1區(qū)域的交叉結(jié)合，但與SARS-CoV S蛋白的結(jié)合和新冠病毒S蛋白的結(jié)合并不一致。此外，在PsV中和試驗中，COVID-19患者血漿不能抑制SARS-CoV感染。

來自COVID-19患者、顯示出較強的新冠病毒中和活性的26份血漿樣本，既不能中和SARS-CoV PsV感染，也不能抑制VSV-G PsV感染。

這里有一個前提是，因為新冠病毒和SARS-CoV之間在S蛋白上氨基酸一致性為77.2%，保守表位可能存在于兩種病毒之間。但這項研究的結(jié)果表明，盡管COVID-19患者的血漿顯示與SARS-CoV存在交叉結(jié)合，但并沒有中和SARS-CoV。這就提示，新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同的。

研究團隊提到，本研究推斷的證據(jù)僅表明，在COVID-19感染期間，針對SARS-CoV和新冠病毒保守表位的交叉中和抗體可能不易被誘導。

患者感染后第10-15天產(chǎn)生中和抗體和結(jié)合抗體

研究團隊監(jiān)測了疾病進程中新冠病毒特異性中和抗體的發(fā)展動力學，對6例患者發(fā)病后不同時間點的血漿進行測定，患者之間中和抗體的發(fā)展動力學相似。所有患者中和抗體的滴度在發(fā)病第10天前較低（ID50: < 200），在發(fā)病第10-15天時升高達到峰值，隨后保持穩(wěn)定。

研究人員還測試了這6例患者血漿中新冠病毒S蛋白（刺突糖蛋白）不同結(jié)合域（RBD、S1和S2）的結(jié)合抗體。中和抗體(右Y軸)和針對RBD（受體結(jié)合域）、S1和S2的結(jié)合抗體(左Y軸)的動力學一致。

S蛋白是冠狀病毒最重要的表面蛋白，它通常決定病毒的宿主范圍和特異性，是宿主中和抗體的重要位點以及疫苗設計的關(guān)鍵靶點。此前的研究表明，冠狀病毒通過S蛋白與受體ACE2結(jié)合，從而介導膜融合和病毒入侵。S蛋白根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)功能又被分為兩個功能單位，即S1和S2蛋白亞基。

研究團隊評估了175名康復患者出院當天血漿中新冠病毒特異性中和抗體滴度和S蛋白結(jié)合抗體的水平。他們觀察到，新冠病毒特異性中和抗體滴度與靶向RBD、S1和S2的S蛋白抗體中度相關(guān)。

他們認為，這提示COVID-19患者對新冠病毒的體液免疫反應發(fā)生在感染后第10-15天。除了RBD結(jié)合域外，S2區(qū)域可能是新冠病毒中和抗體的目標。

不過，由于結(jié)合抗體也可能通過抗體依賴的吞噬作用或抗體依賴的細胞毒性作用來清除病毒，因此中和抗體和結(jié)合抗體對疾病進展的影響值得進一步綜合評價。

總體來說，大多數(shù)COVID-19患者在感染康復期出現(xiàn)了新冠病毒特異性中和抗體。中和抗體滴度在發(fā)病后10-15天達到峰值，此后在患者中保持穩(wěn)定。針對S蛋白不同結(jié)構(gòu)域（包括S1、RBD和S2）的抗體，都可能有助于中和。

大約30%的康復患者產(chǎn)生非常低滴度的中和抗體

值得注意的是，研究團隊觀察到，175名康復患者的血漿中和抗體滴度是存在差異的。ID50s的范圍從低于檢測限（<40）到21567。大約30%的康復患者產(chǎn)生一個非常低水平的中和抗體滴度（ID50: < 500）。不過，這些患者的病程與其他患者相似。

其中10例患者的中和抗體滴度還在檢測極限以下（ID50: < 40）。他們認為，這表明包括T細胞或細胞因子在內(nèi)的其他免疫反應可能有助于這些患者的恢復。

另一方面，2例患者的中和抗體滴度非常高，ID50分別大于15989和21567，但未出現(xiàn)任何抗體相關(guān)的不良反應。

總體來說，大約17%、39%、14%的患者分別顯示中低（ID50: 500-999）、中高（ID50: 1000-2500）、高（ID50: > 2500）中和抗體滴度。

研究團隊還收集并測試了175名患者中47名患者出院后兩周的隨訪檢查中血漿中的中和抗體水平。如圖3C所示，隨訪檢查時采集的中和抗體血漿滴度與出院時采集的無顯著差異。出院時未產(chǎn)生中和抗體的患者此后也未出現(xiàn)中和抗體。

他們認為，這些結(jié)果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能夠在沒有出現(xiàn)高滴度病毒特異性抗體的情況下康復。這些患者如何在沒有中和抗體的幫助下康復，以及是否存在病情反復或再感染的較高風險，都有待進一步研究。

需要注意的是，在使用恢復期血漿進行預防或治療之前，在進行被動抗體治療前，需要對來自康復供體的血漿和血清進行滴定，這是有幫助的。研究團隊提醒，這也是一項簡單的工作，可以使用PsV中和試驗來完成。

中老年康復患者出現(xiàn)更高水平的中和抗體

COVID-19患者的中和抗體滴度還與患者的年齡相關(guān)。

研究團隊觀察到，老年患者比年輕患者更容易誘導更高滴度的中和抗體。如圖4A所示，他們根據(jù)年齡將患者分為三組，分別為年輕人（15-39歲）、中年人（40-59歲）和老年人（60-85歲），每組患者數(shù)量差不多，分別為55例、64例和56例。

中年、老年康復患者的中和抗體滴度明顯高于年輕康復患者，對應的中位ID50s分別為1537、1255、488。年齡與中和抗體滴度呈中度正相關(guān)，證實了年齡在中和抗體產(chǎn)生中的重要作用。中老年康復患者的RBD、S1和S2靶向抗體明顯高于年輕康復患者。然而，患者的年齡和住院時間之間沒有觀察到差異。

研究團隊認為，這些結(jié)果提示高水平中和抗體對清除病毒有一定的作用，對中老年患者的康復有一定的幫助。

另外，COVID-19康復患者的年齡和新冠病毒特異性中和抗體與入院時淋巴細胞計數(shù)呈負相關(guān)，與CRP水平呈正相關(guān)。

值得注意的是，目前的研究顯示，年齡是冠狀病毒感染（包括SARS-CoV、MERS-CoV和新冠病毒）后不良疾病預后的重要預測因素。此前對感染SARS-CoV的恒河猴的研究則表明，年齡較大的恒河猴會引起先天免疫應答升高，導致比年輕的成年恒河猴呈現(xiàn)更嚴重的病理反應。

在這項研究中，中老年患者入院時淋巴細胞計數(shù)較年輕患者低，CRP水平較高。不過，這些患者均未發(fā)展成嚴重病情，且年齡和住院時間在這些患者中無顯著差異。

研究團隊還觀察到中和抗體滴度與血液淋巴細胞計數(shù)呈負相關(guān)，與血液CRP水平呈正相關(guān)，這表明在細胞反應功能障礙或受損時，體液反應可能發(fā)揮重要作用。老年患者入院時血CRP水平較高，淋巴細胞計數(shù)較低，提示先天性免疫應答較年輕患者強烈。這些老年患者中，高水平的中和抗體可能是免疫反應強烈的結(jié)果。

不過，高水平的中和抗體是否能保護這些患者免于進展為嚴重和危重狀態(tài)，值得綜合評價。但在這項研究中，嚴重和危重患者被排除在研究之外，因為在收集樣本之前他們已接受了被動抗體治療。

論文提醒，在本研究中，研究團隊不能直接評價中和抗體對COVID-19患者病毒清除或疾病進展的影響。為解決該問題，應該進行進一步的全面研究。

論文鏈接：https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.20047365v1