神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中主要的細(xì)胞類型，它們之間存在廣泛的相互作用，但其相互作用的分子基礎(chǔ)在很大程度上仍不清楚。

基于此，2025年6月11日，美國加利福尼亞大學(xué)Baljit S. Khakh研究團(tuán)隊(duì)在Neuron雜志發(fā)表了“The cell-surface shared proteome of astrocytes and neurons and the molecular foundations of their multicellular interactions”揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的細(xì)胞表面共有蛋白質(zhì)組及其多細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)。

作者鑒定并繪制了紋狀體中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞表面蛋白（CSPs）圖譜，發(fā)現(xiàn)其中許多蛋白是兩者共有的，構(gòu)成了連接紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元相互作用位點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元細(xì)胞表面共有蛋白質(zhì)組（CS SPAN）。CS SPAN 中富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞粘附分子、轉(zhuǎn)運(yùn)體、離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體等成分。通過追蹤星形膠質(zhì)細(xì)胞CSPs的細(xì)胞來源，識別出星形膠質(zhì)細(xì)胞與多種實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)總體上與人類數(shù)據(jù)一致。在亨廷頓病（HD）小鼠模型中，病理生理變化及其由基因干預(yù)引起的緩解分別伴隨著CS SPAN和CSPs的異常改變與恢復(fù)。CS SPAN中還包含在多種腦部疾病中失調(diào)的分子。本研究從分子層面揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的界面結(jié)構(gòu)，為探索其生理功能及其在腦疾病中的作用提供了機(jī)制性基礎(chǔ)。

 圖一 用于蛋白質(zhì)生物素標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞表面HRP 

本研究的目標(biāo)是系統(tǒng)記錄星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的細(xì)胞表面共有蛋白質(zhì)組。為了鑒定細(xì)胞表面蛋白（CSPs），作者采用了基于鄰近依賴的生物素標(biāo)記技術(shù)，并利用在成年小鼠紋狀體中體內(nèi)表達(dá)的、由腺相關(guān)病毒（AAV）攜帶的細(xì)胞表面定位的辣根過氧化物酶（HRP）實(shí)現(xiàn)對特定細(xì)胞類型的標(biāo)記。還比較了另一種常用的標(biāo)記工具TurboID，但在HEK293細(xì)胞中測試后，選擇了HRP進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記，因?yàn)樗恍枰~外添加ATP，且對細(xì)胞內(nèi)蛋白的標(biāo)記較少。用于HRP的生物素探針（BxxP）無法穿過細(xì)胞膜，因此更有利于標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白。作者構(gòu)建了可在星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元中表達(dá)細(xì)胞表面HRP的AAV病毒載體，并進(jìn)行了驗(yàn)證、細(xì)胞表面蛋白的鑒定、定位分析，以及在亨廷頓病模型中這些蛋白及其動態(tài)變化的評估。紋狀體參與多種疾病的發(fā)生，包括亨廷頓病，同時(shí)也是星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間廣泛接觸的腦區(qū)。其中約95%的神經(jīng)元是DARPP32陽性的中等棘神經(jīng)元（MSNs）。在H?O?和不能透過細(xì)胞膜的BxxP存在的情況下，HRP可以生成反應(yīng)性自由基，從而將附近的蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素。通過免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測了生物素標(biāo)記的效果。S100β和Sox9是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，而NeuN和DARPP32則用于識別中等棘神經(jīng)元。靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的HRP（AstroHRP）主要表達(dá)于約90%的紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞中，而在神經(jīng)元中幾乎不表達(dá)。靶向神經(jīng)元的HRP（NeuroHRP）則在約95%的中等棘神經(jīng)元中表達(dá)，未見于星形膠質(zhì)細(xì)胞。HRP及其介導(dǎo)的生物素標(biāo)記僅出現(xiàn)在大腦注射側(cè)；蛋白標(biāo)記依賴于HRP的表達(dá)以及0.03%H?O?的存在；標(biāo)記的蛋白可以通過鏈霉親和素磁珠富集。在表達(dá)細(xì)胞表面HRP的腦片中觀察到了H?O?介導(dǎo)的生物素標(biāo)記，但在將H?O?加入表達(dá)HRP的腦片裂解液中時(shí)并未出現(xiàn)標(biāo)記信號，這表明不存在非特異性標(biāo)記。

 圖二 紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的CSP譜型分析

在向紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中特異性表達(dá)細(xì)胞表面HRP的AAV注射約4周后，作者分離了紋狀體組織，進(jìn)行免疫組化檢測并富集生物素標(biāo)記的蛋白用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。共使用三批小鼠，分別接受Astro HRP或Neuro HRP處理，并完成CSP標(biāo)記與鑒定。通過比較HRP樣本與對照樣本中蛋白的標(biāo)簽自由定量（LFQ）強(qiáng)度值，并以倍數(shù)變化（FC）進(jìn)行篩選，分別鑒定出688個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞CSPs和584個(gè)神經(jīng)元CSPs。GO分析顯示，這些蛋白主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞外圍、膜固有成分、細(xì)胞連接和突觸，說明HRP有效地標(biāo)記了細(xì)胞表面和胞外蛋白。將Astro HRP和Neuro HRP鑒定到的CSPs與此前利用Lck-BioID2技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的蛋白進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，Astro HRP主要檢測到來自細(xì)胞表面和胞外空間的蛋白，而Astro Lck-BioID2則更多檢測到膜內(nèi)或鄰近區(qū)域的蛋白，Neuro HRP與Neuro Lck-BioID2之間的比較也呈現(xiàn)類似趨勢。這進(jìn)一步驗(yàn)證了Astro HRP和Neuro HRP能夠有效標(biāo)記細(xì)胞表面及胞外蛋白，有助于揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的相互作用。在鑒定出的688個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞CSPs和584個(gè)神經(jīng)元CSPs中，有561個(gè)是兩者共有的。考慮到星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間緊密接觸的特性，這種高度重疊可能表明Astro HRP不僅標(biāo)記了星形膠質(zhì)細(xì)胞表面蛋白，也標(biāo)記了鄰近神經(jīng)元的蛋白，反之亦然。為了驗(yàn)證這種重疊是否反映細(xì)胞間相互作用而非非特異性標(biāo)記，將HRP靶向至內(nèi)皮細(xì)胞表面并鑒定其CSPs，結(jié)果顯示僅有極少數(shù)與星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元CSPs重疊，支持了標(biāo)記方法的特異性。結(jié)果顯示，約三分之二的共有蛋白來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，其余為非富集蛋白。在CS SPAN中，檢測到了多個(gè)已知的星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白如Slc1a2和Bcan，以及神經(jīng)元蛋白如Gpm6a和Slc17a7。此外，還發(fā)現(xiàn)了參與細(xì)胞粘附的GPCRs、神經(jīng)連接蛋白、突觸形成和清除相關(guān)蛋白，以及多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和粘附分子。來自少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘蛋白Plp1也被檢測到，這與紋狀體中豐富的有髓纖維及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的密切接觸一致。在獨(dú)有CSPs中，識別出了典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白如Dag1和S1pr1，以及神經(jīng)元蛋白如Kcnh5。此外，突觸蛋白Vamp2也在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被檢測到，盡管其mRNA主要在神經(jīng)元中表達(dá)，這可能反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的高度包裹狀態(tài)或其蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平的不一致。總的來說，鑒定出大量星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共有的細(xì)胞表面蛋白，構(gòu)建了CS SPAN圖譜，揭示了這兩類細(xì)胞在分子層面的直接互作網(wǎng)絡(luò)。

 圖三 星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的CSPs及其與亨廷頓病、多細(xì)胞相互作用及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系 

在亨廷頓病相關(guān)數(shù)據(jù)分析中，作者將從星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中分別鑒定出的58個(gè)和142個(gè)細(xì)胞表面差異表達(dá)蛋白（CS DEPs）與近期發(fā)表的人類單核RNA測序的HD數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。在從星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到的58個(gè)CS DEPs中，有21個(gè)（36%）在snRNA-seq數(shù)據(jù)中也表現(xiàn)出類似的改變，并主要映射到星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元；其中19個(gè)在N-ZFP干預(yù)后得到恢復(fù)。而在從神經(jīng)元中檢測到的142個(gè)CS DEPs中，有78個(gè)（55%）在snRNA-seq數(shù)據(jù)中一致下調(diào)，主要映射到神經(jīng)元，并且大多數(shù)也能通過N-ZFP恢復(fù)。綜上所述，對HD模型小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的CSPs分析揭示了顯著的疾病相關(guān)變化，這些變化可以被定位、被N-ZFP逆轉(zhuǎn)，并得到了驗(yàn)證。作者揭示了在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元與其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用位點(diǎn)中排名前兩位的兩種CSP蛋白。此外，作者評估了CSSPAN以及CSPs與已知人類基底節(jié)疾病相關(guān)基因之間的重疊情況。結(jié)果顯示，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，由疾病相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)大多屬于CSPs，尤其是來自CS SPAN。數(shù)據(jù)顯示，約20%具有已知人類疾病關(guān)聯(lián)的CSPs屬于CS SPAN。還進(jìn)一步分析了CS SPAN與精神分裂癥和衰老腦組織中鑒定出的“突觸神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞程序”（SNAP）基因之間的重疊，以及與帕金森病（PD）死后snRNA-seq數(shù)據(jù)中改變的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個(gè)核心的SNAP和PD相關(guān)基因也存在于CS SPAN中。最后，CS SPAN中還包括了一些已被鑒定為在小鼠學(xué)習(xí)相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞（LAAs）中表達(dá)的基因。作者的研究結(jié)果表明，CS SPAN介導(dǎo)了與化學(xué)突觸傳遞、細(xì)胞粘附、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及突觸組裝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)機(jī)制和通路，可能在人類疾病和大腦可塑性中發(fā)揮重要作用。

總結(jié)

作者發(fā)現(xiàn)，從星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中檢測到的CSPs不僅包括多個(gè)已知功能的蛋白質(zhì)，也包含許多功能尚未明確的蛋白。這一發(fā)現(xiàn)與以往對星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果一致，說明蛋白表達(dá)與基因表達(dá)之間并非簡單的線性關(guān)系。尤其對于膜蛋白而言，這意味著僅依賴RNA測序可能遺漏了一些重要的信號傳導(dǎo)介質(zhì)。從這一角度出發(fā)，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)鑒定出在CS SPAN中星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞表面共享的蛋白，揭示了這些蛋白所參與的主要功能類別，包括細(xì)胞外基質(zhì)、化學(xué)突觸傳遞、細(xì)胞粘附、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及突觸組裝的調(diào)控。綜上所述，這些鑒定出的蛋白應(yīng)被進(jìn)一步研究以探索與星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用相關(guān)的蛋白質(zhì)機(jī)制的分子基礎(chǔ)及其功能意義。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.05.019

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