快速的葡萄糖供應(yīng)對(duì)動(dòng)物在應(yīng)激反應(yīng)中的生存至關(guān)重要。下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)神經(jīng)元如何精確控制應(yīng)激誘導(dǎo)的葡萄糖釋放的時(shí)間尺度尚不清楚。

2024年10月5日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉際團(tuán)隊(duì)在Nature Communications 上發(fā)表題為《Hypothalamus-sympathetic-liver axis mediates the early phase of stress-induced hyperglycemia in the male mice 》的論文，在該研究中，作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性高血糖在雄性小鼠中至少可以分為兩個(gè)階段:第一個(gè)快速階段是由下丘腦(室旁到腹內(nèi)側(cè)下丘腦)-交感神經(jīng)(白斑中縫核到中外側(cè)核)-肝(HSL)軸活動(dòng)介導(dǎo)的;第二個(gè)延遲階段是由腎上腺活動(dòng)介導(dǎo)的。阻斷HSL軸的活性可削弱捕食誘發(fā)的逃跑反應(yīng)，表明HSL通路的活性是應(yīng)對(duì)應(yīng)激所必需的。作者進(jìn)一步揭示了下丘腦CRH信號(hào)的胞內(nèi)級(jí)聯(lián)，該級(jí)聯(lián)是由GABAA受體β3亞基在S408/409位點(diǎn)磷酸化介導(dǎo)的，從而阻止GABAA受體膜募集。因此，作者揭示了應(yīng)激時(shí)葡萄糖供應(yīng)的精確時(shí)間尺度，分別由腎上腺非依賴性HSL和腎上腺依賴性途徑介導(dǎo)。

急性應(yīng)激時(shí)，CRH調(diào)節(jié)快速和延遲的葡萄糖釋放

當(dāng)面對(duì)壓力源時(shí)，PVN中的CRH神經(jīng)元被激活，導(dǎo)致腎上腺釋放皮質(zhì)酮。作者首先詢問PVN中的CRH神經(jīng)元是否調(diào)節(jié)葡萄糖水平。為避免攝食引起的血糖變化，實(shí)驗(yàn)前禁食小鼠12小時(shí)。通過化學(xué)遺傳學(xué)方法作者發(fā)現(xiàn)，給藥DREADD配體CNO顯著增加CRH神經(jīng)元的放電率和CRH神經(jīng)元中c-fos的表達(dá)。

與對(duì)照組相比，腹腔注射CNO導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組血糖水平升高。為了進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果，作者采用光遺傳學(xué)方法探究PVNCRH神經(jīng)元的活性。正如預(yù)期的那樣，腦切片的體外電生理記錄顯示，當(dāng)暴露于藍(lán)光時(shí)，PVNCRH神經(jīng)元的活性增加。與化學(xué)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)一致，光刺激CRH神經(jīng)元導(dǎo)致血糖水平和皮質(zhì)酮水平顯著升高，這表明PVNCRH神經(jīng)元的激活確實(shí)能夠調(diào)節(jié)葡萄糖水平。

PVNCRH-VMH投射是應(yīng)激時(shí)葡萄糖快速釋放所必需的

為了探索CRH神經(jīng)元可能的下游靶點(diǎn)，作者化學(xué)激活了PVNCRH神經(jīng)元，并對(duì)神經(jīng)元活性標(biāo)記物c-Fos進(jìn)行了免疫染色。刺激PVNCRH神經(jīng)元顯著增加PVNCRH神經(jīng)元中c-fos陽性細(xì)胞數(shù)量。有趣的是，作者還發(fā)現(xiàn)VMH中c- fos表達(dá)增加。SF-1在VMH中特異性表達(dá)。為了進(jìn)一步測(cè)試VMH神經(jīng)元是否參與應(yīng)激反應(yīng)，作者通過光纖記錄鈣信號(hào)發(fā)現(xiàn)在對(duì)急性身體應(yīng)激(包括足部沖擊、水噴霧和尾夾)的反應(yīng)中，總體Ca2+信號(hào)變化20%(用ΔF/F表示)。這表明VMHSF-1神經(jīng)元確實(shí)參與了應(yīng)激反應(yīng)。

應(yīng)激時(shí)由VMHCRHR2介導(dǎo)CRH啟動(dòng)的葡萄糖快速釋放

CRHR1和CRHR2均廣泛分布于大腦中，而VMH中CRH受體亞型以CRHR2為主。為了研究CRHR2是否在應(yīng)激反應(yīng)中負(fù)責(zé)葡萄糖調(diào)節(jié)，作者將不同的CRH受體拮抗劑注入VMH并測(cè)量血糖變化。應(yīng)用CRHR1拮抗劑R121919顯示血糖水平適度變化，而CRHR2拮抗劑Astressin2B與溶劑組相比，在足部休克應(yīng)激期間阻斷了葡萄糖的快速增加。同樣，Astressin2B在面對(duì)水噴、尾夾等其他應(yīng)激源時(shí)，阻斷了葡萄糖的快速升高，但不阻斷延遲期，證實(shí)了應(yīng)激反應(yīng)中CRH信號(hào)介導(dǎo)的高血糖主要是通過VMH中CRHR2的激活介導(dǎo)的。當(dāng)作者將AAV-DIO-GFP注射到Sf-1-Cre小鼠中標(biāo)記VMH神經(jīng)元并使用特異性反義寡核苷酸檢測(cè)CRHR2 mRNA時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)大量的CRHR2 mRNA在VMH背內(nèi)側(cè)表達(dá)。

CRH通過VMH中β3 GABAA受體亞基調(diào)節(jié)抑制性突觸傳遞

作者發(fā)現(xiàn)CRH刺激VMH神經(jīng)元的活動(dòng)。然而，這種興奮作用是否由突觸傳遞介導(dǎo)尚不清楚。為了回答這個(gè)問題，作者采用電壓鉗法記錄VMHSF-1神經(jīng)元的突觸后電流。CRH的應(yīng)用不影響自發(fā)興奮性突觸后電流(sEPSCs)。而灌注GABAA受體拮抗劑PTX阻斷了CRH對(duì)動(dòng)作電位放電的作用，表明抑制電流可能介導(dǎo)了CRH對(duì)VMH神經(jīng)元活性的影響。事實(shí)上，CRH顯著降低了自發(fā)抑制性突觸后電流(sIPSCs)的振幅和頻率。同樣，敲除VMHSF-1神經(jīng)元中CRHr2表達(dá)完全降低了CRH誘導(dǎo)的sIPSC幅度和頻率抑制，提示CRHR2激活可抑制SF-1神經(jīng)元的抑制性張力。

為了可視化GABAARs的細(xì)胞表面動(dòng)力學(xué)，作者在N2a細(xì)胞系中表達(dá)pHluorin(一種ph敏感的GFP變體)標(biāo)記的GABAAR亞基(β3和γ2)和CRHR2，以實(shí)時(shí)測(cè)量受體的遷移率。作者發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)CRH， β3 GABAAR亞基減少，而γ2亞基表達(dá)細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化。這一結(jié)果表明，含有β3亞基的GABAAR亞單位是CRH細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的特異性靶點(diǎn)。先前的研究表明，GABAAR亞基的膜轉(zhuǎn)運(yùn)很可能通過其胞內(nèi)域的磷酸化來調(diào)節(jié)，特別是β3亞基的Ser408/409磷酸化位點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)CRH給藥后，Ser408/409的磷酸化程度顯著增加。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，β3 GABAAR亞單位的Ser408/409磷酸化位點(diǎn)是VMH中CRH信號(hào)通路的特異性靶點(diǎn)。

下丘腦CRH信號(hào)通過HSL軸活性調(diào)控葡萄糖的快速釋放

作者之前的研究表明VMH可以通過交感神經(jīng)通路控制葡萄糖代謝。作者假設(shè)VMHCRHR2調(diào)節(jié)應(yīng)激誘導(dǎo)的葡萄糖釋放可以通過交感神經(jīng)傳入肝臟介導(dǎo)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了CRHr2-Cre小鼠。首先，作者通過在CRHr2-Cre小鼠的VMH中注射順行失蹤病毒發(fā)現(xiàn)，在腦干區(qū)域，包括迷走神經(jīng)背運(yùn)動(dòng)核(DMV)和蒼白中縫核(Rpa)，發(fā)現(xiàn)密集的標(biāo)記終末，在孤束核(NTS)中發(fā)現(xiàn)少量纖維。光刺激VMHCRHR2 - Rpa通路可顯著提高血糖。

為了測(cè)試VMHCRHR2是否與Rpa神經(jīng)元形成單突觸連接，作者在CRHR2神經(jīng)元中表達(dá)AAV-DIO-ChR2。在藍(lán)光照射下，Rpa神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了時(shí)間鎖定的突觸后興奮電流，該電流可被突觸前阻斷劑TTX阻斷，并被TTX + 4-AP恢復(fù)，表明VMHCRHR2與Rpa神經(jīng)元之間存在單突觸連接。

HSL軸介導(dǎo)的快速葡萄糖釋放對(duì)于捕食誘導(dǎo)的飛行反應(yīng)是必需的

為了進(jìn)一步證實(shí)下丘腦CRH信號(hào)與肝臟之間的直接聯(lián)系，作者在Sf-1-Cre小鼠的VMH中注射了AAV-DIO-mCherry，并在肝臟中注射了跨突觸逆行示跡劑偽狂犬病毒(PRV)。作者在VMH中發(fā)現(xiàn)了大量的GFP+神經(jīng)元，它們與mCherry標(biāo)記的SF-1共定位，表明VMH-肝臟存在連接。在PVN中，作者還發(fā)現(xiàn)了gfplar標(biāo)記的肝臟PRV的共定位和CRH的免疫染色，表明PVNCRH -肝臟存在投射。接下來，作者發(fā)現(xiàn)HSL軸活性在應(yīng)激反應(yīng)的早期(0-3分鐘)是必需的，而腎上腺活性在應(yīng)激反應(yīng)的后期(3分鐘)葡萄糖釋放是必需的。

當(dāng)面臨潛在威脅時(shí)，快速能量供應(yīng)對(duì)于動(dòng)物的生存至關(guān)重要。接下來，作者想知道VMH中的CRH信號(hào)是否對(duì)于捕食性線索誘導(dǎo)的飛行反應(yīng)是必需的。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者在VMH中注射了CRHR2拮抗劑Astressin2B。在模擬接近的捕食者時(shí)，動(dòng)物會(huì)開始逃逸并躲進(jìn)巢穴。當(dāng)通過局部注射Astressin2B阻斷VMH中的CRH信號(hào)時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)逃離巢穴的潛伏期延長，飛行速度降低。這表明VMH中的CRHR2對(duì)于捕食性線索誘導(dǎo)的飛行反應(yīng)是必要的。

總結(jié)

在本研究中，作者定義了一個(gè)下丘腦-交感-肝臟軸，它在應(yīng)激反應(yīng)期間獨(dú)立于腎上腺活動(dòng)而介導(dǎo)快速葡萄糖釋放。應(yīng)激信號(hào)通過CRHR2介導(dǎo)的β3 GABAA受體膜招募來調(diào)節(jié)抑制性張力，從而整合到VMH中，作為血糖水平的中樞控制。

總之，作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)激肽CRH啟動(dòng)了由快速和延遲兩個(gè)階段組成的葡萄糖釋放過程，分別由HSL和腎上腺激素調(diào)節(jié)。早期階段由PVN-VMH-Rpa-交感神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)，在急性應(yīng)激期間維持快速的葡萄糖供應(yīng)，這對(duì)動(dòng)物在面對(duì)應(yīng)激源時(shí)的生存至關(guān)重要。

找實(shí)驗(yàn)方法，上腦聲常談。