疼痛是一種保護(hù)身體的不愉快體驗(yàn)，它通過(guò)引發(fā)自衛(wèi)反應(yīng)來(lái)保護(hù)身體免受傷害。近年來(lái)，已有多項(xiàng)研究對(duì)大腦高級(jí)中樞的神經(jīng)回路和分子機(jī)制進(jìn)行了解析，在理解疼痛調(diào)節(jié)方面取得了突破性進(jìn)展。然而大腦如何處理來(lái)自身體不同部位的痛覺(jué)信號(hào)，以及這些信號(hào)如何導(dǎo)致不同的感知和行為反應(yīng)，這些機(jī)制尚不完全清楚。疼痛可以分為內(nèi)臟痛和軀體痛兩種不同的痛覺(jué)類(lèi)型，它們雖然在大腦中有共同的神經(jīng)區(qū)域，但引發(fā)不同的行為反應(yīng)。內(nèi)臟刺激會(huì)引發(fā)腹部的收縮反應(yīng)，而體表刺激會(huì)導(dǎo)致后肢撤回或舔舐等行為，但不會(huì)引發(fā)腹部的收縮反應(yīng)。盡管人們對(duì)疼痛的傳遞和調(diào)節(jié)已有深入了解，但關(guān)于大腦如何編碼內(nèi)臟和軀體刺激以產(chǎn)生不同感知和行為的具體機(jī)制，仍然是一個(gè)未解之謎。傳統(tǒng)認(rèn)為這兩種疼痛由大腦中的兩個(gè)不同系統(tǒng)分別進(jìn)行處理：內(nèi)側(cè)疼痛系統(tǒng)和外側(cè)疼痛系統(tǒng)。然而，缺乏實(shí)質(zhì)性證據(jù)支持這種假設(shè)性的不同處理。最近的一項(xiàng)功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟痛和軀體痛實(shí)際上都激活了相同的腦區(qū)，如中腦、小腦、海馬體、島葉皮層、丘腦和下丘腦等，這表明內(nèi)臟痛和軀體痛的處理可能并不像之前認(rèn)為的那樣完全分離。因此，對(duì)于這兩種疼痛在大腦中的具體識(shí)別和編碼方式，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。

摘要圖

下丘腦室旁核（paraventricular hypothalamus, PVH）是腦中一個(gè)關(guān)鍵的核團(tuán)，對(duì)多種生理過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，包括內(nèi)臟和軀體疼痛、恐懼、焦慮和進(jìn)食。蘇州大學(xué)徐廣銀教授團(tuán)隊(duì)在在Neuron雜志上發(fā)表研究論文Distinct circuits and molecular targets of the paraventricular hypothalamus decode visceral and somatic pain，認(rèn)為內(nèi)臟刺激和軀體刺激會(huì)在PVH中誘導(dǎo)不同的神經(jīng)集群，從而形成對(duì)疼痛信號(hào)的特異性處理和后續(xù)行為輸出。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)多項(xiàng)先進(jìn)的技術(shù)手段驗(yàn)證了內(nèi)臟痛和體表痛會(huì)激活PVH中不同的神經(jīng)元群，這些神經(jīng)元群分別投射到外側(cè)隔核（lateral septal nucleus, LSV）和未定帶（zona incerta, ZIC）的不同區(qū)域，從而分別介導(dǎo)內(nèi)臟痛和體表痛。

圖源 Neuron

為了研究由內(nèi)臟和軀體疼痛激活的神經(jīng)系統(tǒng)在PVH中的表現(xiàn)，我們使用了Tet-off病毒系統(tǒng)并結(jié)合了c-Fos染色（圖1）。研究人員將AAV2/9-c-fos-tTA和AAV2/9-TRE3g-mCherry混合注射到PVH，使小鼠接受內(nèi)臟疼痛刺激，結(jié)腸擴(kuò)張（colorectal distention, CRD）激活的PVH神經(jīng)元群能被mCherry標(biāo)記。在灌注前1.5小時(shí)，小鼠接受了VFF（von Frey filament）刺激，且VFF激活的 PVH 神經(jīng)元群將被c-Fos染色標(biāo)記。通過(guò)mCherry表達(dá)和c-Fos染色證明了PVH神經(jīng)元群激活的分布，發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)元群被內(nèi)臟和體感覺(jué)疼痛同時(shí)激活。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，40.68%的PVH神經(jīng)元僅表達(dá)腹部疼痛引起的mCherry，36.65%僅表達(dá)體表疼痛激活的c-Fos，23.67%表達(dá)兩種疼痛的mCherry和c-Fos。PVH神經(jīng)元的數(shù)量在腹部和體表疼痛中沒(méi)有顯著差異，但mCherry和c-Fos雙陽(yáng)性神經(jīng)元的百分比顯著低于mCherry或c-Fos單陽(yáng)性神經(jīng)元。這表明CRD和VFF激活的PVH神經(jīng)元是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的人群，專(zhuān)門(mén)識(shí)別腹部疼痛和體表疼痛信號(hào)。

圖1 腹腔和體表疼痛激活的神經(jīng)元群在PVH中的表現(xiàn)

內(nèi)臟和軀體疼痛激活不同的PVH神經(jīng)系統(tǒng)，可能是由于不同的分子表達(dá)。因此，為了研究標(biāo)記為CRD和VFF的PVH神經(jīng)元群體的分子特征，研究人員采用了一種名為fLCM-seq的新方法。他們利用Tet-off系統(tǒng)結(jié)合c-Fos染色，特異性地標(biāo)記了CRD和VFF激活的PVH神經(jīng)元群，并通過(guò)激光捕獲顯微解剖技術(shù)（laser capture microdissection, LCM）以單細(xì)胞分辨率精確收獲了標(biāo)記為CRD、VFF和CRD和VFF共標(biāo)記的細(xì)胞。隨后，研究人員檢查了這三組PVH神經(jīng)集體的轉(zhuǎn)錄水平差異，計(jì)算高度可變基因并進(jìn)行PCA分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自同一神經(jīng)集體的細(xì)胞形成了明顯不同的聚類(lèi)，說(shuō)明這三組PVH神經(jīng)集體的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異；通過(guò)LCM分析獲得的細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)這三組PVH主要由谷氨酸能神經(jīng)元組成，且?guī)缀鯖](méi)有抑制性神經(jīng)元，與之前關(guān)于PVH主要由谷氨酸類(lèi)神經(jīng)元組成的結(jié)論一致。通過(guò)計(jì)算差異表達(dá)基因（DEGs），研究人員發(fā)現(xiàn)P2rx3在CRD標(biāo)記組高度特異性表達(dá)，Vipr2在VFF標(biāo)記組高度特異性表達(dá)。P2X3R和VIPR2在疼痛調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步的基因功能分析表明，CRD標(biāo)記組中多個(gè)基因參與了正向調(diào)節(jié)疼痛感知的生物過(guò)程，VFF標(biāo)記組中多個(gè)基因與激活腺苷酸環(huán)化酶活性相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明P2X3R可能特異性與臟器疼痛調(diào)節(jié)相關(guān)，VIPR2可能特異性與皮膚疼痛調(diào)節(jié)相關(guān)。

圖2 PVH 神經(jīng)集群中CRD標(biāo)記和VFF標(biāo)記的神經(jīng)元群體顯示出明顯不同的轉(zhuǎn)錄譜

研究人員對(duì)P2X3R和VIPR2在CRD標(biāo)記和VFF標(biāo)記的PVH神經(jīng)元上的表達(dá)進(jìn)行了免疫熒光驗(yàn)證。結(jié)果表明，CRD標(biāo)記的PVH神經(jīng)元中61.10%表達(dá)P2X3R，而VFF標(biāo)記的PVH神經(jīng)元中只有1.09%表達(dá)P2X3R；VFF標(biāo)記的PVH神經(jīng)元中53.58%表達(dá)VIPR2，而CRD標(biāo)記的PVH神經(jīng)元中只有1.69%表達(dá)VIPR2。這些結(jié)果表明P2X3R和VIPR2特異性表達(dá)在CRD標(biāo)記和VFF標(biāo)記的PVH神經(jīng)元上。此外，研究人員使用ATP或VIP傳感劑，檢驗(yàn)ATP和VIP是否在腹部疼痛或肌肉疼痛刺激下特異性釋放，其結(jié)果表明，在CRD或VFF刺激下，PVH中表達(dá)ATP傳感劑的神經(jīng)元顯示出銳利的反應(yīng)，而在肌肉疼痛刺激下則沒(méi)有反應(yīng)。同樣地，將AV2/9-hSyn-VIP1.7注射到PVH中，以評(píng)估VFF或CRD刺激期間VIP的釋放，發(fā)現(xiàn)PVH中表達(dá)VIP傳感劑的神經(jīng)元在肌肉刺激下顯示出顯著反應(yīng)，但在腹部疼痛刺激下沒(méi)有反應(yīng)。總之，腹部和肌肉疼痛刺激可以選擇性增加ATP和VIP釋放，這表明ATP-P2X3R和VIP-VIPR2通路可能是PVH如何區(qū)分性調(diào)節(jié)腹部和肌肉疼痛的機(jī)制。

圖3 PVH神經(jīng)集群中帶有CRD和VFF標(biāo)記的細(xì)胞明顯地表達(dá)P2X3R和VIPR2蛋白

本研究涉及到了一組小鼠的疼痛相關(guān)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔ趦?nèi)臟疼痛實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)結(jié)直腸擴(kuò)張CRD進(jìn)行評(píng)估，小鼠用異氟烷輕度麻醉，然后將一個(gè)定制的彈性聚丙烯氣球（2厘米，氣球是由將手術(shù)手套的指頭連接到輸液管上制成的）插入結(jié)直腸，放置在肛門(mén)3厘米處，氣球末端的輸液管用壓敏膠帶牢固地固定在老鼠的尾巴上，以防止滑落或脫落。在結(jié)直腸擴(kuò)張之前，讓老鼠在單獨(dú)的透明盒中適應(yīng)30~60分鐘。氣球用血壓計(jì)緩慢均勻地充氣，直到老鼠出現(xiàn)明顯的腹部收縮反應(yīng)，以此確定內(nèi)臟痛閾值。每只老鼠接受5次，間隔3分鐘的重復(fù)結(jié)直腸擴(kuò)張。所有內(nèi)臟痛行為測(cè)試均采用盲法進(jìn)行。在體表疼痛實(shí)驗(yàn)中，使用纖毛機(jī)械刺激針（von Frey filaments, VFF）誘導(dǎo)后肢撤回反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，為了盡量減少環(huán)境干擾，在進(jìn)行體表痛行為測(cè)試前3天，讓小鼠熟悉測(cè)試環(huán)境。測(cè)試前，將小鼠放入一個(gè)專(zhuān)門(mén)的透明盒（4.5×3.5×10.0厘米）中，底部有升高的網(wǎng)格，并讓其適應(yīng)30~60分鐘。將一系列校準(zhǔn)的Semmes-Weinstein monofilaments從0.008 - 2g的壓力應(yīng)用于后爪的足底表面，直到小鼠應(yīng)激并退出刺激。陽(yáng)性反應(yīng)包括突然的爪子撤回、抽搐和舔爪。每次將每個(gè)VFF應(yīng)用于后肢足底5次（每次保持3秒），其中引起3次陽(yáng)性反應(yīng)的VFF的最小彎曲力被認(rèn)為是爪子撤回閾值。所有體表疼痛行為測(cè)試也都采用盲法進(jìn)行。

該研究發(fā)現(xiàn)，PVH神經(jīng)元可以通過(guò)不同的神經(jīng)回路和分子機(jī)制分別調(diào)控內(nèi)臟疼痛和體性疼痛。具體來(lái)說(shuō)，PVH中的P2X3R+神經(jīng)元通過(guò)投射到腹外側(cè)隔核LSV來(lái)調(diào)控內(nèi)臟疼痛,而VIPR2+神經(jīng)元?jiǎng)t通過(guò)投射到前扣帶皮質(zhì)ACC來(lái)調(diào)控體性疼痛。這表明PVH內(nèi)存在功能分化的神經(jīng)亞群,能夠?qū)Σ煌?lèi)型的疼痛信號(hào)進(jìn)行獨(dú)立編碼和調(diào)控。P2X3R+神經(jīng)元通過(guò)釋放ATP激活LSV中的神經(jīng)元從而誘發(fā)內(nèi)臟疼痛相關(guān)行為，而VIPR2+神經(jīng)元?jiǎng)t通過(guò)釋放VIP激活A(yù)CC中的神經(jīng)元從而誘發(fā)體性疼痛相關(guān)行為。這些發(fā)現(xiàn)揭示了PVH神經(jīng)元調(diào)控不同疼痛類(lèi)型的具體分子機(jī)制。

總而言之，這項(xiàng)研究揭示了PVH神經(jīng)元在內(nèi)臟疼痛和體性疼痛調(diào)控中的分子和神經(jīng)回路機(jī)制，為進(jìn)一步理解疼痛的中樞編碼和調(diào)控提供了重要線索。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討PVH神經(jīng)元與其他腦區(qū)的相互作用，以及其在慢性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用，為疼痛的精準(zhǔn)調(diào)控治療提供新的靶點(diǎn)。

找實(shí)驗(yàn)方法，上腦聲常談。

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