酒精使用障礙在全球范圍內極為普遍，其特征是在戒斷期間會出現嚴重的疼痛敏感性。

基于此，2024年9月27日中國科學技術大學生物物理與神經生物學系張智研究團隊在Science Advances雜志發表了“A neural circuit for alcohol withdrawal–induced hyperalgesia in a nondependent state”揭示了非依賴狀態下酒精戒斷引起的痛覺過敏的神經回路。

在這里，作者建立了一個在成癮之前酒精戒斷（EW）期間痛覺過敏的小鼠模型，以研究其發病窗口和潛在機制。通過體內顯微內窺鏡和雙光子鈣成像的能技術，確定了從背側海馬CA1谷氨酸能神經元（dCA1Glu）到前扣帶皮層谷氨酸能神經元（ACCGlu）的神經回路通路，該通路在EW小鼠的痛覺過敏中被激活。化學遺傳學抑制這一通路可以減輕EW小鼠的痛覺過敏，而激活則在未經EW的小鼠中重現了EW誘導的痛覺過敏。這些發現表明，在小鼠對酒精產生依賴之前，dCA1Glu到ACCGlu的神經通路參與推動EW誘導的痛覺過敏。

圖一 在非依賴狀態下，小鼠的酒精戒斷誘導痛覺過敏

以前建立酒精依賴小鼠模型的方法是通過慢性間歇性酒精暴露，動物至少接受一個月（平均）的四個重復周期的酒精蒸汽暴露，或至少連續3周自由飲用液態酒精。因此，為了探索短期飲酒戒斷對小鼠疼痛敏感性的影響，作者縮短了暴露時間，建立了一個連續飲酒的小鼠模型，允許小鼠自由飲用20%的酒精兩周，每六天有24小時的戒斷期。在第二次戒酒酒精消耗后24小時，發現在用von Frey刺激戒酒組（EW組）小鼠右后爪時，其機械閾值顯著低于對照組小鼠。相比之下，通過Hargreaves測試評估的熱閾值在EW小鼠和對照組之間沒有顯著差異。

作者在EW期間觀察到的機械閾值降低可以持續長達3天。此外，在對照組小鼠中，機械或熱閾值沒有觀察到變化。然后作者使用曠場測試（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測試了兩周的酒精消耗戒斷是否也伴隨著焦慮樣情感障礙，結果顯示，在進入中心區域的頻率或在OFT測試中運動的距離沒有顯著差異，在EPM測試中進入開放臂的頻率或在開放臂中花費的時間也沒有明顯差異。為了進一步測試EW小鼠是否發展為酒精依賴或保持非成癮狀態，在第二次戒斷期后兩周的酒精消耗期間，對兩組小鼠進行了偏好測試。EW組和對照組小鼠都表現出對蔗糖的高度偏好和對酒精的非常低的消耗，而在EW組和對照組小鼠之間，蔗糖或酒精的攝入量沒有差異，這表明EW小鼠保持了與對照組小鼠相當的對蔗糖的高度偏好，在連續兩周的酒精消耗后，對酒精沒有明顯的偏好。

此外，作者還量化了這種范式下小鼠的酒精消耗量，發現兩周內酒精攝入量沒有變化。還通過收集EW小鼠的尾靜脈血測試了血漿酒精濃度，發現第一次和第二次戒斷后血漿酒精濃度沒有差異，這表明在連續酒精暴露后血漿酒精濃度保持相對穩定的狀態。此外，血漿酒精濃度在2小時后逐漸降低，比第二次戒斷后降低明顯，并且在第二次EW后8小時無法檢測到。此外，作者發現EW小鼠的體重增長趨勢與對照組小鼠相比沒有差異，這表明當前研究中兩周的連續酒精暴露沒有影響小鼠的健康狀態。這些結果共同表明，兩周的酒精消耗戒斷可以在小鼠中誘導疼痛敏感化，而不是酒精依賴。

圖二 在戒酒小鼠中dCA1Glu活性增強

海馬尤其是背側CA1區域，是大腦中對酒精敏感的目標，可能涉及與急性或慢性酒精消耗或戒斷相關的疾病。為了探究dCA1在EW誘導的痛覺過敏中的作用及其機制，作者首先通過免疫熒光染色檢測這一區域的c-Fos表達，結果顯示與對照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1中c-Fos信號顯著增強；為了測試dCA1Glu神經元的神經興奮性，在對照和EW轉基因Thy1-黃色熒光蛋白（YFP）小鼠的腦片上進行了體外電生理記錄。與對照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1Glu神經元活性顯著升高，表現為放電率增加和電流誘發的動作電位的閾值降低，而靜息膜電位沒有明顯變化。此外，作者還進行了顯微內窺鏡實驗，將GCaMP 6m注射到EW和對照組C57小鼠的dCA1，以在體內直觀觀察dCA1Glu神經元活性。EW小鼠的dCA1Glu神經元的鈣活性和強度顯著高于對照組。這些結果共同揭示，在小鼠形成依賴之前，短期酒精消耗戒斷期間dCA1Glu神經元活性增加。

為了進一步探索dCA1Glu神經元如何參與疼痛敏感化，作者使用了化學遺傳學抑制EW和對照組小鼠的dCA1Glu神經元。行為測試顯示，與感染對照病毒的dCA1中的EW小鼠相比，化學遺傳學抑制dCA1Glu神經元的EW小鼠的機械閾值顯著升高，而化學遺傳抑制dCA1Glu神經元對hM4Di-對照組小鼠的機械閾值沒有影響。此外，作者還通過化學遺傳學激活了未經處理的C57小鼠的單側dCA1，在這些未經處理的小鼠中，特異性激活dCA1Glu神經元導致對側后爪的機械閾值降低，與感染對照病毒的小鼠相比，在曠場測試的總行程沒有變化。此外，根據廣泛用于評估癲癇嚴重程度的Racine量表，作者研究了行為記錄中的癲癇樣行為，如口部和面部運動、頭部點頭、前肢陣攣、站立和跌倒，而在化學遺傳學激活dCA1Glu神經元的小鼠中幾乎沒有觀察到癲癇樣行為。這些結果支持dCA1Glu神經元有助于與EW相關的痛覺過敏。

圖三 戒斷短期飲酒后，前扣帶回谷氨酸能神經元活動增強

為了直觀觀察并量化dCA1Glu神經元到ACC的投射活動，作者在ACC中注射了逆行病毒并進行了全細胞膜片鉗記錄。結果顯示，在第二次戒酒后24小時，與對照組相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經元的放電率升高，而電流誘發的動作電位的閾值降低。此外，在第二次戒酒后24小時，與對照組小鼠相應的神經元相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經元的鈣信號明顯增強。這些結果表明，在小鼠形成依賴之前，戒酒期間投射到ACC的dCA1Glu神經元活動增加。免疫熒光染色顯示，戒酒小鼠ACC中c-Fos的表達高于對照組動物。此外，在EW和對照組Thy1-YFP小鼠的腦片上進行的體外電生理記錄顯示，ACCGlu神經元的活性增強，放電率增加，電流誘發的動作電位的閾值相對于對照組小鼠降低。

為了在單細胞水平上觀察ACCGlu神經元活動的變化，作者進行了活體雙光子鈣成像，結果顯示，在第二次戒酒后24小時，ACCGlu神經元檢測到的鈣信號強度顯著增加。為了檢驗在連續短期酒精消耗后戒酒對ACCGlu神經元對機械刺激的敏感性，隨后應用光纖記錄自由活動小鼠的鈣信號，在第二次戒酒后24小時，戒酒小鼠右后爪接受0.07克von Frey細絲刺激后，ACCGlu神經元中的鈣信號迅速增加。為了進一步確定機械刺激對ACCGlu神經元活動的影響，在ACC中注射了AAV-CaMKIIα-GCaMP6m病毒的自由活動小鼠上進行活體顯微內窺鏡記錄 ACCGlu神經元的鈣信號度。結果顯示，在第二次戒酒后24小時，與對照組小鼠相比，戒酒小鼠的ACCGlu神經元的鈣信號強度顯著增加。這些結果表明，在小鼠發展成依賴之前，敏感化的ACC谷氨酸能神經元對短期飲酒戒斷后具有重要作用。

總結：

作者的研究表明dCA1Glu到ACCGlu的神經回路在促進短期酒精消耗后戒斷引起的痛覺過敏中發揮功能作用，這種非依賴性酒精消耗與疼痛敏感化的生理聯系為大腦中不同神經系統之間錯綜復雜的網絡相互作用提供了越來越多的證據，這些相互作用共同介導了酒精依賴的發展。