這是神經(jīng)科學(xué)家一直思考的一個(gè)重要問題。近20年來，隨著光遺傳等工具的開發(fā)和成熟，其中一種理論關(guān)注到了“記憶印跡細(xì)胞（engram cells）”，在與學(xué)習(xí)記憶高度相關(guān)的腦區(qū)海馬（hippocampus）利用即早基因（immediate early gene），如c-fos等，可以標(biāo)記一群“儲(chǔ)存記憶”的細(xì)胞1,2。利用光遺傳激活或者抑制這群細(xì)胞能夠“產(chǎn)生”或“擦除”記憶3,4。然而到底哪些神經(jīng)元更容易被招募為engram cells呢？

加拿大多倫多大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)巧妙利用鈣成像，光遺傳等技術(shù)對這些問題進(jìn)行了解答，該工作于2024年5月1日于Neuron雜志發(fā)表，題目為Excitability mediates allocation of pre-configured ensembles to a hippocampal engram supporting contextual conditioned threat in mice。他們發(fā)現(xiàn)，在海馬的CA1腦區(qū)，在事件發(fā)生前的3小時(shí)內(nèi)更加興奮的神經(jīng)元更容易被分配為恐懼記憶的engram cell。同時(shí)，在恐懼記憶發(fā)生前更加興奮的細(xì)胞群體（ensemble）也傾向于分配為engram cell ensemble，在恐懼記憶形成時(shí)，這些細(xì)胞群體內(nèi)細(xì)胞間的功能連接增強(qiáng)。

圖1 利用光遺傳興奮一小部分CA1椎體神經(jīng)元使其偏向于成為條件恐懼記憶的印跡細(xì)胞

首先作者利用條件恐懼記憶范式，在training前興奮一群NpACY陽性神經(jīng)元，并在recall中光遺傳抑制他們，發(fā)現(xiàn)小鼠的freezing行為下降，即恐懼記憶回憶減少。那么，在生理狀況下自發(fā)高興奮性的細(xì)胞是否也更傾向于招募為engram cells呢？因此作者利用scFLARE技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是由斯坦福大學(xué)Alice Ting實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，這種細(xì)胞整合子可以標(biāo)記興奮性高（胞內(nèi)鈣離子濃度高）且受到光照的細(xì)胞，并表達(dá)相關(guān)的基因（此處為NpHR3.0，一種紅光導(dǎo)致抑制的光遺傳元件）5,6。當(dāng)他們抑制在training前3h更加興奮的這群神經(jīng)元也可以發(fā)現(xiàn)freezing行為的減少。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)提前興奮的細(xì)胞在freezing行為發(fā)生之前也有更高的放電。以上結(jié)果都說明了在恐懼記憶形成前一段時(shí)間內(nèi)高興奮性的細(xì)胞更傾向于成為engram cell。

圖2 穩(wěn)定功能連接的細(xì)胞群興奮性隨著天數(shù)變化，但條件恐懼記憶當(dāng)天最興奮的一群細(xì)胞被招募為印跡細(xì)胞

之后作者利用TRAP2策略標(biāo)記engram cell并利用雙光子成像記錄其在training前五天的細(xì)胞放電情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞在前五天的興奮性存在波動(dòng)，而在training當(dāng)天興奮性遠(yuǎn)高于non-engram cells。同時(shí)，這群engram cell之間放電的功能連接性（functional connectivity）顯著高于non-engram cells，證明他們更傾向于屬于同一個(gè)細(xì)胞集群。這項(xiàng)結(jié)果說明恐懼記憶形成的當(dāng)天最興奮的細(xì)胞集群會(huì)被分配為印跡細(xì)胞。

圖3 印跡細(xì)胞集群在恐懼記憶形成之中和之前具有更高的興奮性

那么這群細(xì)胞在學(xué)習(xí)過程中的放電模式是否有改變呢？作者利用自由移動(dòng)的單光子成像，將在測試期間放電高于平均值的細(xì)胞視為印跡細(xì)胞，其中在test期間有18%的細(xì)胞被監(jiān)測到，其中有46%的細(xì)胞為印跡細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在freezing行為中放電更高，同時(shí)更能響應(yīng)電擊，具有更高的空間編碼能力。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞在恐懼記憶產(chǎn)生，即training時(shí)，以及其之前3小時(shí)內(nèi)均有更高的放電活性，但是與non-engram ensemble相比，兩類細(xì)胞之間的功能連接強(qiáng)度并無差異，但均高于隨機(jī)。

圖4 訓(xùn)練階段特異性穩(wěn)定印跡細(xì)胞集群

之前的結(jié)果都是研究兩兩細(xì)胞之間的相關(guān)性，接下來作者利用非負(fù)矩陣分解得到更多細(xì)胞組成的集群，每個(gè)集群中有多于2個(gè)細(xì)胞。如Fig 4B所示，每個(gè)集群放電的相關(guān)性較高，顏色陰影畫出了該集群中細(xì)胞共同放電的時(shí)刻。作者發(fā)現(xiàn)這些集群在training過程中的放電模式與test過程更為相似，集群中細(xì)胞放電的相關(guān)性也更高。因此作者提出一個(gè)模型：海馬CA1中的神經(jīng)元的興奮性處于波動(dòng)之中，在訓(xùn)練前短時(shí)間內(nèi)興奮性更高的神經(jīng)元在訓(xùn)練過程中更傾向于編碼恐懼記憶，同時(shí)這些神經(jīng)元之間的功能連接增強(qiáng)。最終形成了engram cell ensemble（Fig 4E）。

總結(jié)

本文巧妙地利用光遺傳，雙光子/單光子鈣成像等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元的興奮性影響其被分配為印跡細(xì)胞的偏向性。本文發(fā)現(xiàn)，高興奮性的神經(jīng)元更容易被分配為engram cell，同時(shí)在training過程中會(huì)增加這群神經(jīng)元的興奮性和之間的功能連接。同時(shí)，在training前功能連接更強(qiáng)的一群細(xì)胞，即pre-configured ensembles，更容易被分配成同一群engram ensemble。

本文揭示了一個(gè)重要的科學(xué)問題，即engram cell產(chǎn)生的機(jī)制。但本文中記錄到的non-engram cell數(shù)目約是engram cell的幾倍，可能會(huì)導(dǎo)致一些統(tǒng)計(jì)上的差異，并且例如Fig3中以z score超過0的方式定義engram cell標(biāo)準(zhǔn)較為寬松，可能導(dǎo)致一些non-engram cell被識(shí)別為engram cell，可能部分污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，本文利用鈣信號(hào)的皮爾森相關(guān)系數(shù)來計(jì)算細(xì)胞兩兩之間的功能連接，可以考慮利用膜片鉗等電生理手段對細(xì)胞間連接進(jìn)行更精細(xì)的測量。

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