如何調(diào)控干細胞的發(fā)育潛能是干細胞再生醫(yī)學領域的重要科學問題之一。在人類著床前胚胎發(fā)育的過程中，胚胎的發(fā)育潛能受到動態(tài)調(diào)控并發(fā)生變化，這是個體發(fā)育的基礎。從人受精卵到8細胞卵裂球時期的胚胎細胞具有全能性（Totipotency），能夠發(fā)育成包括胚胎、胎盤和卵黃囊在內(nèi)的完整個體。隨著發(fā)育進程的推進，人胚胎細胞喪失了全能性的分子特征，發(fā)育潛能逐漸受限。然而，在這一過程中形成的人著床前囊胚上胚層細胞仍然具有向胚內(nèi)與胚外譜系分化的潛能，由其建立的人原始態(tài)多能干細胞（Na?ve pluripotent stem cells）也具備了形成胚內(nèi)、胚外譜系的能力。當前，對于人全能性調(diào)控機制的了解仍然不多，特別是對調(diào)控人全能性的信號通路知之甚少。另一方面，與小鼠原始態(tài)多能性調(diào)控機制的研究相比，對于人原始態(tài)多能性調(diào)控機制的了解仍然相當有限。要想系統(tǒng)性地研究這些問題，需要合適的模型和策略。 

人潛能擴展多能干細胞（Human extended pluripotent stem cells）是2017年由北京大學干細胞研究中心鄧宏魁團隊建立的一類具備胚內(nèi)、胚外發(fā)育潛能的新型多能干細胞。團隊隨后的研究揭示人潛能擴展多能干細胞是一類處于原始態(tài)多能性（Na?ve pluripotency）與始發(fā)態(tài)多能性（Primed pluripotency）之間的中間態(tài)細胞，具備了部分的原始態(tài)多能性分子特征，不具備全能性的整體分子特征。因此，通過遺傳篩選分析人潛能擴展多能干細胞與人原始態(tài)多能干細胞的調(diào)控差異，有助于揭示人原始態(tài)多能性調(diào)控的核心機制。此外，以人潛能擴展多能干細胞為起點開展的遺傳篩選，也有助于發(fā)現(xiàn)調(diào)控人全能性的新因子、新通路。

2023年10月23日，北京大學基礎醫(yī)學院徐君課題組、鄧宏魁課題組與中科院動物研究所韓春生課題組合作在Life Medicine雜志在線發(fā)表了題為A CRISPR/Cas9-based kinome screen identifies ErbB signaling as a new regulator of human na?ve pluripotency and totipotency的研究論文，基于人潛能擴展多能干細胞轉化為人原始態(tài)多能干細胞的體系，利用CRISPR/Cas9技術開展了全激酶組敲除篩選，系統(tǒng)鑒定分析了調(diào)節(jié)人原始態(tài)多能性的信號通路，并在隨后的化學小分子篩選驗證中發(fā)現(xiàn)抑制ErbB信號通路會促進體外人原始態(tài)多能性和全能性的誘導。

研究人員首先在人潛能擴展多能干細胞上建立了一套可誘導的CAS9表達系統(tǒng)，隨后在細胞中轉入攜帶全激酶組sgRNA載體的慢病毒庫，通過Dox誘導CAS9表達，在人潛能擴展多能干細胞中構建起了全激酶組敲除的文庫。隨后，研究人員采用了兩種策略來分析鑒定影響人原始態(tài)多能性調(diào)控的激酶：1）通過將此文庫細胞切換到目前已報道的人原始態(tài)多能干細胞培養(yǎng)條件PXGL與5i/LA下進行持續(xù)傳代培養(yǎng)篩選，收集富集存活細胞；2）通過人原始態(tài)多能干細胞特異表達的表面分子標記SUSD2直接富集在人潛能擴展多能干細胞培養(yǎng)基中出現(xiàn)的人原始態(tài)多能性細胞群。通過分別分析以上兩種策略收集的細胞群中富集的sgRNA序列，研究人員在整合信息后得到了對于人原始態(tài)多能性誘導和維持調(diào)控發(fā)揮作用的潛在激酶列表。

在此基礎上，研究人員整理了針對這些激酶的小分子抑制劑，并構建了可以指示由人潛能擴展多能干細胞向人原始態(tài)多能干細胞轉變的KLF17基因報告體系。通過在人潛能擴展多能干細胞中篩選針對以上激酶的化學小分子，研究人員發(fā)現(xiàn)ErbB信號通路的抑制劑阿法替尼（Afatinib）在PXGL條件下可以進一步顯著激活KLF17陽性細胞的比例。通過流式分析以及qPCR分析，研究人員進一步驗證了ErbB信號通路的抑制可以促進人原始態(tài)多能性分子特征的誘導。由于KLF17同時也在人全能性細胞中富集表達，研究人員進一步嘗試抑制ErbB通路是否對于人全能性誘導具有調(diào)控作用。利用具有人全能性基因TPRX1報告體系的人胚胎干細胞系，研究人員發(fā)現(xiàn)ErbB信號通路的抑制能夠在人全能性細胞誘導條件e4CL下進一步提升TPRX1陽性細胞的比例和強度。此外，在此條件下誘導的人全能性細胞中的多個典型人全能性分子標記表達水平得到了明顯提升。

研究人員進一步在不同的人多能干細胞培養(yǎng)條件下（始發(fā)態(tài)多能干細胞、潛能擴展多能干細胞以及原始態(tài)多能干細胞）研究ErbB信號通路抑制劑阿法替尼與厄洛替尼(Erlotinib)對細胞轉錄組的影響。分析表明ErbB通路的抑制在不同人多能干細胞培養(yǎng)條件下均促進誘導了人全能性分子標記的表達提升。通過進一步的生信分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ErbB信號通路與人全能性8細胞胚胎以及體外誘導的人8細胞樣干細胞的調(diào)控網(wǎng)絡存在關聯(lián)，其中KLF5與TFAP2C是關聯(lián)節(jié)點。為了研究KLF5、TFAP2C對ErbB信號通路是否有調(diào)控作用，研究人員在人潛能擴展多能干細胞中分別瞬時過表達了這兩個基因，發(fā)現(xiàn)瞬時過表達KLF5與TFAP2C上調(diào)了ErbB家族的EGFR與ERBB2的基因表達。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)KLF5的小分子抑制劑SR18662不僅下調(diào)了ERBB2與ERBB3的表達，還上調(diào)了全能性分子標記的表達。這些結果表明ErbB信號通路可能在人早期胚胎發(fā)育過程中起到了調(diào)控作用，并與人全能性的分子調(diào)控網(wǎng)絡存在相互調(diào)控的關系。

總的來說，這項研究揭示了參與人原始態(tài)多能性調(diào)控的新激酶和相關信號通路。該研究中獲得的篩選數(shù)據(jù)集為未來研究調(diào)控人原始態(tài)多能性和全能性的信號通路和調(diào)節(jié)因子提供了參考資源。此外，這項研究還發(fā)現(xiàn)了ErbB信號通路的抑制可以促進體外人全能性細胞的誘導。這些發(fā)現(xiàn)有助于加深對于人原始態(tài)多能性和全能性調(diào)控機制的理解，并為未來優(yōu)化人原始態(tài)多能性干細胞和全能性干細胞的體外培養(yǎng)條件提供了新線索。

北京大學干細胞研究中心徐君研究員、鄧宏魁教授以及中國科學院動物研究所韓春生研究員為本文的共同通訊作者，北京大學基礎醫(yī)學院博士生李佳宇為本文的第一作者。該研究得到了科技部國家重點研發(fā)計劃的經(jīng)費支持。

英文全文鏈接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad037

引用本文：

Jiayu Li, Xiwen Lin, Liangfu Xie, Jingru Zhao, Chunsheng Han, Hongkui Deng, Jun Xu, A CRISPR/Cas9-based kinome screen identifies ErbB signaling as a new regulator of human na?ve pluripotency and totipotency, Life Medicine, 2023;, lnad037, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad037