肝纖維化發展而來的肝硬化已成為全球排名第十三和我國排名第十的致死性疾病，且缺乏有效臨床治療手段。硬化肝組織的典型特征是形成以膠原蛋白瘢痕為主的高度交聯的細胞外基質（Extracellular Matrix, ECM），其交聯程度的增加與其抵抗蛋白酶水解、纖維化逆轉困難有著密切關系。高度交聯的瘢痕不僅會直接損傷肝組織結構，還會衍生出異常生物力學信號去調節細胞向促纖維化表型分化，從而促進纖維化疾病進展。膠原瘢痕的形成涉及多種交聯反應，其中報道最廣泛的是賴氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase，LOX）介導的膠原交聯反應，但LOX靶向治療在臨床試驗中均未取得理想治療效果，意味著需要進一步探究交聯的膠原瘢痕在肝硬化中的作用。除了LOX外，谷氨酰胺轉移酶（Transglutaminase，TGM）介導的交聯也被許多研究報道參與纖維化肝組織中的ECM交聯。TGM促相鄰膠原原纖維之間形成γ-Glutamyl-ε-Lysine交聯鍵，從而增加膠原瘢痕的穩定性、不可逆性和抗重塑性。然而，目前還沒有上市的抗TGM藥物用于肝硬化治療。雖然已有許多研究報道了TGM在纖維化肝組織中異常上調，但TGM如何導致交聯膠原瘢痕的異常特性，以及TGM交聯如何通過調節肝組織的機械微環境來促進纖維化進程仍不清楚。因此，對肝硬化組織中TGM交聯ECM進行深入表征和重建是非常必要的，并且有望探究纖維化疾病進程中相關細胞的下游調控機制。

近日，清華大學醫學院杜亞楠課題組在Life Medicine上以Letter形式發表了題為“Transglutaminase-crosslinked extracellular matrix in cirrhotic liver tissues provides profibrotic mechano-microenvironment for cells”的文章。該文章主要研究了肝硬化組織中的細胞外基質的TGM交聯特性及其對細胞的影響。研究發現，在肝硬化組織中，TGM及其交聯產物γ-Glutamyl-ε-Lysine的表達顯著增加，并且與膠原瘢痕共定位。通過體內定量和體外重建TGM交聯的膠原基質模型，揭示了TGM交聯可顯著改變膠原纖維的結構和力學特性，導致異常的生物物理微環境，調控肝竇內皮細胞和巨噬細胞的表型和功能。這些結果揭示了TGM交聯在肝纖維化疾病中的潛在機制，并通過重建基于ECM的疾病模型為機制研究和臨床應用提供了新的見解。

為了精準探究ECM的交聯特征，避免肝組織內細胞組分及代謝產物對交聯度定量分析的影響，團隊通過利用課題組此前報道的針對細胞外基質交聯度的絕對定量方法（Absolute Quantification of Matrix-specific Crosslinking, AQMC），有效分離出了健康及硬化肝組織的細胞外基質，并結合液相色譜-質譜聯用的方案證明高度TGM交聯的肝臟ECM是肝硬化的重要病理特征，并且在臨床肝硬化組織樣本及肝纖維化動物模型中證明了該結論。

為了揭示TGM交聯作用對ECM的影響，研究團隊首次在體外構建了具有與體內ECM交聯度相似的TGM交聯膠原基質，從力學粘彈性、結構參數、交聯度等方面重現了體內肝纖維化發展過程中ECM的病理特征。借助透射電鏡和光鑷技術，首次從單根膠原纖維的維度闡釋了TGM交聯反應對膠原基質的影響，發現TGM交聯會導致相鄰纖維之間相互纏繞、集結成束、形成粗大的纖維束結構，導致其剛度增大，應力松弛速率降低，從而導致TGM交聯的膠原纖維更難被膠原酶降解。

接下來，研究團隊利用TGM交聯的體外仿生病理基質模型，探究了TGM交聯的膠原基質對肝竇內皮細胞(LSECs)和巨噬細胞的調控作用。體外實驗表明，TGM交聯基質中異常的機械微環境導致LSECs細胞-細胞粘附異常下調，細胞-ECM粘附異常上調。這些力學信號導致YAP表達增加和纖維化相關基因表達上調。TGM交聯基質也引發了原代LSECs出現開窗結構的病理性喪失。生理性窗孔結構的喪失和間隙結構的形成通常與LSECs對肝損傷和慢性疾病的細胞反應有關。這些結果表明，TGM交聯的基質促進了LSECs的異常表型，并可能有助于纖維化肝組織中形成漏出的血竇。

研究結果還進一步揭示了巨噬細胞與TGM交聯基質的細胞-ECM相互作用升高，且在TGM交聯基質上生長的巨噬細胞比在未交聯基質上生長的巨噬細胞顯示出更高水平的ECM粘附分子和YAP表達的上調。巨噬細胞中YAP表達異常也可能是由于基質應力松弛減少引起的，并與疾病進展過程中免疫反應失調有關。同時，在TGM交聯的基質中，巨噬細胞介導的膠原降解明顯減少。

綜上所述，本文在人和小鼠肝硬化組織中驗證了ECM的高水平TGM交聯特性，并在體外成功重建了TGM交聯的膠原基質，再現了纖維化肝ECM的TGM交聯程度。TGM交聯通過增加基質剛度和降低應力松弛率，顯著增強了基質力學性能，構成了導致細胞異常行為的力學微環境。體外實驗表明，生長在TGM交聯基質上的LSECs和巨噬細胞顯示出促進的細胞-ECM相互作用，YAP表達和纖維化相關表型。以上研究結果揭示了TGM交聯在肝纖維化疾病中的潛在機制，為纖維化疾病致病機理研究和臨床應用提供了新的思路。

清華大學醫學院生物醫學工程系教授、清華-北大生命科學聯合中心研究員杜亞楠為該文章的通訊作者，清華大學醫學院生物醫學工程系博士呂丞、醫學院博士生孔文瑜為共同第一作者，醫學院博士生張巖、劉志強、梁愷倪對本研究有重要貢獻。該研究得到了國家杰出青年科學基金項目（82125018）的支持。

英文全文鏈接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad030

引用本文：

Cheng Lyu, Wenyu Kong, Yan Zhang, Zhiqiang Liu, Kaini Liang, Yanan Du, Transglutaminase-crosslinked extracellular matrix in cirrhotic liver tissues provides pro-fibrotic mechano-microenvironment for cells, Life Medicine, 2023, lnad030, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad030