1999年，科學(xué)家在最簡單的真核生物釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了具有延長壽命的Sir2基因。此后，在小鼠等嚙齒類動物中，Sir2的同源基因SIRT6同樣被發(fā)現(xiàn)有此魔力。自此，SIRT6被科學(xué)界奉為經(jīng)典的“長壽基因”，成為人類掌控衰老速度的一個熱門突破口。

北京時間8月23日凌晨，中國科學(xué)院干細(xì)胞與再生創(chuàng)新研究院等研究團隊在國際頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）刊發(fā)歷時3年的一項最新的合作研究成果：首次實現(xiàn)SIRT6在非人靈長類動物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型。

非人靈長類作為人類的“表親”，在基礎(chǔ)科研和醫(yī)學(xué)研究中具有其他模式生物無可比擬的優(yōu)勢。國家杰出青年基金獲得者、干細(xì)胞國家重大科學(xué)研究計劃首席科學(xué)家、中科院生物物理所研究員劉光慧是該項成果的通訊作者之一，他在接受澎湃新聞（www.kxwhcb.com）采訪時表示，“關(guān)于SIRT6這個長壽基因在包括人在內(nèi)的靈長類中所起的作用，例如是否可以調(diào)節(jié)衰老，此前由于研究手段的限制使得人們無法回答這個問題。”

有趣的是，這項初衷為解析長壽基因如何調(diào)節(jié)食蟹猴衰老的研究，最終卻顛覆了此前對長壽基因的傳統(tǒng)認(rèn)知。一直致力于通過研究人類加速衰老疾病的機制來解決諸多老齡化問題的劉光慧等人，這次的注意力從生命終端被拉到了生命的起點：經(jīng)典“長壽基因”的缺失居然導(dǎo)致食蟹猴在子宮內(nèi)發(fā)育不良并出現(xiàn)出生后早夭。

首次在非人靈長類猴子身上得到的這一結(jié)論，讓劉光慧等格外興奮。“此前在嚙齒類等動物中看到的一些“加速衰老的癥狀”可能并不完全是“衰老”的表型；根據(jù)基于食蟹猴的研究結(jié)果，SIRT6在胚胎發(fā)育早期的缺失可能更多的是延遲了機體的發(fā)育。SIRT6缺乏小鼠可能也具有發(fā)育遲緩的表型，但可能由于嚙齒類和靈長類動物具有較大的種屬差異，例如，小鼠具有更長的端粒等，所以SIRT6敲除的小鼠可以在出生后存活4周甚至更長的時間。”

值得注意的是，SIRT6導(dǎo)致食蟹猴子宮內(nèi)發(fā)育遲緩這一點，目前在人類中也有了蛛絲馬跡。

就在劉光慧等人的論文發(fā)表前不久，美國有研究團隊在《基因與發(fā)育》（Genes & Development）發(fā)文，該研究團隊通過篩查流產(chǎn)胎兒發(fā)現(xiàn)，在人類SIRT6基因上的功能突變也會引起胎兒子宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。

劉光慧表示，“這實際上同我們在猴子身上看到結(jié)果非常類似，很好地佐證了我們的結(jié)論。” SIRT6敲除猴子模型或可以為人類圍產(chǎn)期致死綜合征的發(fā)病機理提供新的研究途徑。

除劉光慧之外，該研究的通訊作者還包括中科院動物研究所李偉研究員和胡寶洋研究員。中科院生物物理研究所張維綺研究員，中科院動物研究所萬海峰助理研究員、馮桂海副研究員和曲靜研究員為共同第一作者。中國干細(xì)胞與生殖研究領(lǐng)域權(quán)威、中科院動物研究所研究員、中科院院士周琪也參與并指導(dǎo)了此項研究。

讓食蟹猴喪失長壽基因

Sirtuin蛋白家族本質(zhì)上是一類從酵母到人類高度保守的去乙酰化酶，其備受關(guān)注源于和人類孜孜以求的長壽扯上了關(guān)系。

除釀酒酵母之外，線蟲、果蠅，直至到更高等一點的小鼠，科學(xué)家均發(fā)現(xiàn)有Sir2的同源基因存在。而在哺乳動物細(xì)胞里，目前已知的Sir2同源基因有7個，即SIRT1至SIRT7。

相信紅酒有助長壽的人或許對SIRT1并不陌生。有研究者認(rèn)為，紅酒中包含的白藜蘆醇（Reseratrol）能夠通過激活SIRT1來使得哺乳動物壽命延長。2008年，英國制藥巨頭葛蘭素史克（GSK）還付出7億多美元購得SIRT1藥物開發(fā)的一項技術(shù)。盡管如此，白藜蘆醇的作用機制和療效在科學(xué)界還存在著一定的爭議。

相比于SIRT1，人們認(rèn)為SIRT6在衰老和壽命調(diào)控中同樣具有重要的作用。SIRT6敲除小鼠壽命會縮短，表現(xiàn)出加速衰老的特點，例如皮下脂肪缺失，脊柱彎曲、骨量減少、端粒縮短等。人們相信，SIRT6對于哺乳動物來說是一個經(jīng)典的‘長壽蛋白”，具有調(diào)控機體衰老的作用。

劉光慧表示，“目前人們廣泛應(yīng)用的SIRT6敲除小鼠早衰模型具有重要的科學(xué)價值，不僅可以用于研究嚙齒類動物衰老的規(guī)律，而且人們可以利用這個模型進(jìn)行藥物篩選和評價。具有延長早衰小鼠壽命活性的化合物可能對于人類衰老性疾病的防治具有提示和借鑒意義。”

然而，受限于基因編輯技術(shù)等原因，SIRT6這一重要的調(diào)控衰老的開關(guān)此前從未在猴子或人類身上被科學(xué)家隨意開啟或關(guān)閉。此前在2016年，劉光慧團隊僅在人類間充質(zhì)干細(xì)胞中通過基因編輯敲除SIRT6，并觀察到SIRT6的缺失確實能夠?qū)е氯烁杉?xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡。

“高效、徹底地在猴子體內(nèi)敲除特定基因的技術(shù)難度非常大，迄今為止還沒有敲除任何衰老和長壽基因的報道。”論文共同通訊作者李偉研究員提到，“需要在胚胎發(fā)育早期運用非常高效的CRISPR技術(shù)，這樣才能干凈地敲掉SIRT6基因，使之后產(chǎn)生的機體的所有細(xì)胞都不再有這個基因。”

基因敲除食蟹猴產(chǎn)生示意圖。

而在此番研究中，李偉和劉光慧等人借助高效CRISPR–Cas9基因編輯技術(shù)最終成功獲得SIRT6全身敲除的食蟹猴。

研究團隊共制備98個食蟹猴受精卵， 其中48個發(fā)育、形態(tài)學(xué)正常的基因敲除胚胎被移植到12只代孕猴子中。有4只代孕猴子受孕成功，其中3只完成了大約165天的懷孕周期，每只均生下一只小母猴。另一只在懷孕中期流產(chǎn)了一只公猴。

“早產(chǎn)兒”僅存活數(shù)小時

按照實驗計劃，研究團隊將會花上比在小鼠等模式動物身上多得多的時間來觀察食蟹猴的“早衰”。畢竟，如果一只猴子的壽命能達(dá)到20余年，樂觀一點的話，研究團隊希望在猴子出生后的1年至數(shù)年后能觀察到加速衰老的跡象。

不過，這些實驗預(yù)期在SIRT6基因敲除食蟹猴出生后的數(shù)小時后即被完全打破節(jié)奏。

論文中提到，SIRT6敲除猴子出生時明顯偏小，體重比野生型新生猴子約輕3.5倍，相當(dāng)于這些野生型新生猴子在2-4個月胎齡時的大小。

“壽命只有幾個小時，這些剛出生的SIRT6敲除的猴子非常小，發(fā)育速度幾乎減慢了一倍，但它們還是足月生產(chǎn)出來了。這些“早產(chǎn)”的猴子在出生后是不能很好存活的，各器官組織都遠(yuǎn)沒有達(dá)到可以在母體外存活的成熟度。”李偉表示。

也就是說，SIRT6敲除導(dǎo)致食蟹猴在子宮內(nèi)出現(xiàn)了全身發(fā)育遲緩，導(dǎo)致類似“早產(chǎn)”而無法在出生后生存。

出生大小、體重差異比較。

論文共同通訊作者胡寶洋提到，“我們檢測了SIRT6敲除的所有食蟹猴，在基因組和表觀基因組水平都沒有發(fā)現(xiàn)任何“加速衰老”的特征，相反看到了更加不成熟的發(fā)育早期狀態(tài)。而皮下脂肪減少，骨密度減少，腸上皮受損等在SIRT6敲除小鼠中被認(rèn)為是加速衰老的特征，我們在SIRT6敲除食蟹猴身上同樣也看到了。不過，2-4個月胎齡的野生型猴子也具有類似的表型，說明這些未必是衰老的特征。”

胡寶洋認(rèn)為，或許科學(xué)家們在小鼠身上看到的相關(guān)異常并不完全是加速衰老， SIRT6在食蟹猴中的缺失阻滯了器官的發(fā)育，發(fā)育的時鐘被撥回到胎兒期的特定階段。“我們在猴子里觀察到的許多現(xiàn)象與小鼠都不太一致。”

此外，同新生的野生型猴子相比，SIRT6敲除食蟹猴的腦更小，大腦和小腦半球的皮質(zhì)層更薄，類似于野生型猴的胎兒。研究團隊認(rèn)為，基于這些數(shù)據(jù)，SIRT6可能是食蟹猴腦發(fā)育過程中神經(jīng)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控開關(guān)，SIRT6的缺失會推遲神經(jīng)元的成熟。

研究團隊隨后在分子機制層面解釋已有的結(jié)論。他們比較了SIRT6敲除食蟹猴和野生型新生猴子7種器官中全基因組RNA的表達(dá)，鑒定出至少在一種器官中，兩者存在著多達(dá)11001個基因表達(dá)的差異。其中在至少四種器官中，有1026個基因表達(dá)存在差異。

而在所有存在表達(dá)量差異的基因中，長鏈非編碼核糖核酸 H19（最早被鑒定出的印跡基因之一，印記基因被認(rèn)為與發(fā)育和很多疾病相關(guān)）上調(diào)最為明顯，在SIRT6敲除食蟹猴腦部的表達(dá)量是野生型新生猴子的27.5倍。

而此前有研究已經(jīng)得出結(jié)論，H19表達(dá)在胚胎發(fā)育過程中對包括大腦在內(nèi)的各組織發(fā)育具有非常關(guān)鍵的作用。

在人類中會如何？

在猴模型中，敲除經(jīng)典“長壽基因”SIRT6帶來了顛覆性的新認(rèn)知，那如果進(jìn)一步延伸到人類，結(jié)果又會如何？人類的“表親”是否幫助準(zhǔn)確預(yù)演了結(jié)果？

在研究衰老調(diào)控的同時長期研究干細(xì)胞的劉光慧想到的是對人類干細(xì)胞“動刀”。研究團隊采用TALEN基因編輯技術(shù)獲得SIRT6敲除的人類胚胎干細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)而將這種萬能的“種子細(xì)胞”誘導(dǎo)分化成神經(jīng)前體細(xì)胞。

“我們利用現(xiàn)有的成熟的研究平臺，可以通過對人的干細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，進(jìn)而研究定蛋白對人類干細(xì)胞或終末分化細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響。”劉光慧提到，和眾多致力于建立非人靈長類疾病模型的團隊不同，他們更關(guān)注于將食蟹猴研究中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)規(guī)律在人類干細(xì)胞中體系加以深入進(jìn)一步研究和驗證。

研究團隊在人類神經(jīng)干細(xì)胞中得到了和在SIRT6敲除食蟹猴腦中類似的結(jié)論。SIRT6敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)元分化的延遲，研究人員未能在顯微鏡下看到成片連接的特征性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SIRT6敲除的人類神經(jīng)細(xì)胞中也具有較高的H19轉(zhuǎn)錄本水平。

人類干細(xì)胞神經(jīng)分化比較。

接下來的問題是，如果要疏通所謂的“通路”，研究團隊必須還要回答SIRT6是否直接控制H19表達(dá)？研究團隊最終發(fā)現(xiàn)，受SIRT6調(diào)控的乙酰化組蛋白H3K56ac（組蛋白H3第56位賴氨酸殘基乙酰化修飾）在其中是中間一環(huán)。

正常情況下，SIRT6能結(jié)合到H19上游的印記調(diào)控區(qū)，SIRT6作為一種組蛋白去乙酰化酶可以使得組蛋白去乙酰化，從而導(dǎo)致H19轉(zhuǎn)錄沉默。由此在神經(jīng)分化的過程中，H19轉(zhuǎn)錄水平并不會特別高，神經(jīng)分化程序保持正常。

研究團隊稱，這也就意味著，SIRT6可以通過介導(dǎo)H19印記調(diào)控區(qū)的組蛋白去乙酰化來反式抑制H19的表達(dá)。

然而，在 SIRT6敲除的人類神經(jīng)前體細(xì)胞模型中，看到的一個結(jié)果就是SIRT6的缺乏使得H3K56ac增多，同時還伴隨有更多的H19轉(zhuǎn)錄的反式激活因子CTCF。這些因素都導(dǎo)致H19升高，從而抑制神經(jīng)分化。

實際上，在SIRT6敲除食蟹猴中同樣觀察到，H3K56ac在多種組織中均增加。和上述結(jié)論一致的是，SIRT6敲除食蟹猴中H19的表達(dá)因此而大幅增加。

SIRT6-H3K56ac-H19通路。

SIRT6-H3K56ac-H19這條通路在實驗室條件下的人類干細(xì)胞模型中被拼接完整。而在人體中，這條通路實際上也在若隱若現(xiàn)。

此前有研究證明，H19在人體中過量表達(dá)被證明和銀羅素綜合征（SRS）相關(guān)。銀羅素綜合征又稱先天侏儒癥，發(fā)病率只有十萬分之一，它的特點即是嚴(yán)重的子宮內(nèi)和出生后生長發(fā)育遲緩。

同樣有力的一點是，2018年3月，《基因與發(fā)育》發(fā)表美國科研團隊的一項成果顯示，人類中SIRT6的功能突變（D63H）會引起胎兒子宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。

劉光慧表示，“該研究團隊主要通過篩查流產(chǎn)的胎兒，發(fā)現(xiàn)有某些胎兒攜帶有SIRT6單點突變，而突變位點剛好是去乙酰化酶的活性位點，他們看到的包括神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩等表型，實際上跟我們在食蟹猴中看到的很類似，非常好地佐證了我們的發(fā)現(xiàn)。”

劉光慧認(rèn)為，研究團隊建立了一個全新的人類出生前發(fā)育遲緩（圍產(chǎn)期致死）綜合征的研究體系。“SIRT6作為表觀遺傳因子可以調(diào)節(jié)靈長類動物的出生前發(fā)育，而在臨床上，我們的發(fā)現(xiàn)有助于深入理解因子宮內(nèi)發(fā)育遲緩而導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)或新生兒死亡的分子基礎(chǔ)。接下來更為重要的科學(xué)問題是，在臨床上有多少胎兒發(fā)育遲緩的病例與SIRT6基因的突變有關(guān)，我們?nèi)绾伟l(fā)展有效的生物醫(yī)學(xué)手段進(jìn)行干預(yù)和治療？”