·“早期器官的形成和發育是發育生物學中一個比較重要的階段，但這是一個‘黑匣子’，大家對它都不了解，兩個研究團隊通過體外培養來模擬胚胎在體內的發育，但和體內（胚胎發育）是否完全一樣，有待進一步研究。”

當地時間5月11日，《細胞》（Cell）雜志刊登了兩篇背靠背論文，兩個研究團隊通過各自的創新性平臺將非人靈長類胚胎的體外培養延長至25天，重現并系統研究了靈長類胚胎早期發育階段的多個重要事件。

據悉，早期胚胎發育異常與出生缺陷直接相關，研究早期胚胎發育過程、探究發育機理，有助于揭示病理性胚胎發生機制，提升相關疾病診療效率。有數據顯示，目前已知的出生缺陷病種超過8000種，中國出生缺陷發生率約為5.6%，每30秒鐘就會有一名缺陷兒出生。

“這兩項工作最主要的貢獻是把靈長類胚胎體外培養的時間延長至25天。這兩個團隊之前也發表過論文，將靈長類胚胎的體外培養時間延長到20天，這次又延長了5天，這樣就可以看到原腸運動和早期器官分化等胚胎早期發育階段的重要事件。” 5月13日，同濟大學生命科學與技術學院院長、長期從事胚胎發育與體細胞重編程的表觀調控機制以及干細胞轉化醫學研究的高紹榮教授向澎湃科技表示。

“早期器官的形成和發育是發育生物學中一個比較重要的階段，但這是一個‘黑匣子’，大家對它都不了解，兩個研究團隊通過體外培養來模擬胚胎在體內的發育，但和體內（胚胎發育）是否完全一樣，有待進一步研究?！备呓B榮說。

據悉，人早期胚胎發育起始于受精卵（胚胎期第0天）。受精卵經過數次卵裂形成囊胚，囊胚于胚胎期第7天左右種植入母體子宮并進一步發育，于胚胎期第14天啟動原腸運動。原腸運動是早期胚胎發育過程中的里程碑事件，在此過程中，胚胎細胞發生大規模分化、遷移和重排，并形成外、中、內三胚層和體軸。

外胚層于胚胎期第20天左右進一步發育形成位于中間的神經板（也稱為神經外胚層，neural plate or neural ectoderm）、位于兩側的表皮外胚層（surface ectoderm）和位于兩者之間的神經板邊緣（neural plate border）。神經板彎曲、折疊、增厚并進一步閉合，形成神經管（neural tube）。閉合的神經管沿胚胎背腹軸分化出不同的神經祖細胞。神經管形成的過程稱為神經胚形成（neurulation）。中、內胚層則進一步發育出體節、心臟、腸管等早期器官的原基，胚胎自此進入更加復雜的器官發育階段。

由于人早期胚胎樣品極難獲取，以上事件在人類胚胎中無法被直接探究和揭示。過去，研究人員已通過體外胚胎培養技術初步揭示了人胚胎期第14天之前的發育事件，但14天后的發育事件則無從知曉，因為人類胚胎體外研究須遵循必須在胚胎期14天前終止的倫理規則。因此，研究人員轉而使用與人類進化和發育生物學特征高度相似的靈長類胚胎來替代人類胚胎，搭建非人靈長類胚胎體外培養體系，以理解早期胚胎發育調控機制。

猴胚體外培養延長至25天

第一篇論文由省部共建非人靈長類生物醫學國家重點實驗室、昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院譚韜、陳永昌、季維智團隊，以及中國人民解放軍總醫院、血液與健康全國重點實驗室劉兵團隊及德州西南醫學中心（University of Texas, Southwestern Medical Center at Dallas, UTSW）吳軍團隊合作完成，題為《從囊胚到早期器官形成的子宮外猴胚培養》（Ex utero monkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis）。該團隊開發了一種3D培養系統——優化猴子宮外培養（Enhanced Monkey Ex Utero Culture , EMEUC），實現了食蟹猴胚胎體外25天的長時程培養。利用該平臺，研究人員系統研究了原腸運動及造血等早期組織器官發生的譜系特化軌跡和分子演進規律。

譚韜等人論文截圖。

在這項研究中，譚韜等人的團隊首先優化了前期食蟹猴胚胎培養系統，借助細胞外基質構建了3D培養環境，同時借助葡萄糖的加入，促進了胚胎體外發育，培養胚胎在形態、發育進程等與體內胚胎高度一致，大約對應體內的卡內基階段（carnegie stage）8c。

借助這一優化的3D培養體系，譚韜等人觀察到早期胚胎發育過程的多個關鍵事件。他們發現EMEUC培養的胚胎除了早期神經分化，還出現了造血譜系特化，體外胚胎的造血譜系特化高度模擬了體內卵黃囊的兩個波次造血發生，研究團隊捕獲并識別了猴第一波次造血的關鍵前體細胞（包括生血成血管細胞、第一波次造血祖細胞），這也是迄今為止研究人員首次在非人靈長類胚胎中精確識別和系統解析到它們。此外，與以往的人多能干細胞的體外分化體系相比，體外培養的猴胚能夠產生更接近人體內第二波次造血的生血內皮細胞，表明該體系有望成為更合適的靈長類早期造血的研究模型。

除了外胚層和中胚層的譜系特化外，譚韜等人團隊還觀察到內胚層的特化，在體外培養猴胚胎中發現了早期腸（primitive gut）的形成, 其與體內猴胚胎及人胚胎腸亞群高度一致。進一步的研究揭示了分別與前腸和后腸形成相關的信號通路，并提出內臟內胚層細胞參與了前、后腸發育過程。

第二篇論文來自中國科學院動物研究所的王紅梅研究員、郭帆研究員、李偉研究員和美國賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania) 尼古拉斯·普拉切塔（Nicolas Plachta）教授，題為《3D培養體系獲得食蟹猴早期神經胚胎形成的過程》（Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture）。研究者建立了一個可支持食蟹猴胚胎體外發育至受精后25天的3D長時程培養體系，并基于該體系探究了靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經發育過程中的核心事件和譜系特征。

王紅梅等人論文截圖。

在這項研究中，王紅梅等人的團隊首先比較了人類和非人靈長類胚胎2D和3D體外培養體系中胚胎的大小和存活率，發現2D和3D培養體系都能支持胚胎發育至胚胎期第20天。在2D體系下，胚胎由于胚外組織發育旺盛而迅速增大，但內部的胚體發育并不好。而在3D體系下，胚胎的胚外組織生長受限，但胚體結構顯著發育。為了保證胚體的發育，研究者繼續優化3D體系，優化后的體系能支持33.7%的食蟹猴胚胎發育到胚胎期第25天，該體系被命名為3D長時程培養體系（prolonged in vitro culture，pIVC）。

借助pIVC系統，王紅梅等人團隊確認體外胚胎重現了早期神經胚胎形成的多個關鍵過程，包括神經嵴形成與特化、神經管閉合、神經前體細胞的區域化、神經前體細胞分化形成神經元的過程等。

pIVC胚胎神經管細胞的特化。 中科院動物所 供圖

此外，王紅梅等人還通過單細胞多組學測序技術，對9個pIVC胚胎的3850個單細胞的轉錄組和1862個單細胞的DNA甲基化和染色質可及性進行測序和分析，結果證實了體外培養的胚胎形成了內、中、外三個胚層，包括原始生殖細胞，并且建立了晚期原腸運動階段的DNA甲基化和染色質可及性特征。

據《自然》報道，英國劍橋大學（the University of Cambridge）發育生物學家娜奧米·莫里斯（Naomi Moris）表示，這些研究在開發能比以前更長時間地維持子宮外胚胎的方法方面邁出了重要的一步。但她也提出了警示，“在實驗室培養的胚胎看起來和行為像真實的東西之前，還有很長的路要走。它們（體外培養的胚胎）看起來仍然與我們期望的略有不同。肯定還有改進的余地。”

“14天倫理準則”是否可以改變？

人類胚胎發育研究一直遵循“14天倫理準則” ，即在人類胚胎體外研究工作中，自受精之日起，人類胚胎體外培養的時間不得超過14天。

1978年，全球首例試管嬰兒的誕生引起了社會各界對胚胎體外培養的巨大關注。次年，美國道德咨詢委員會（Ethics Advisory Board）向美國衛生教育與福利部（U.S. Department of Health, Education, and Welfare，HEW）提交了一份報告，首次明確了人胚胎體外培養的14天界限。隨后，英國政府召集了16位專家（包括醫生、科研人員等）組成“沃諾克委員會”（Warnock Committee），該委員會于1984年提出政策和立法建議：“由體外受精產生的人類胚胎，無論是冷凍狀態下或非冷凍狀態下，如果沒有進行胚胎移植，不能在體外存活至超過受精后第14天?！蓖瑫r建議將超出期限的人類胚胎研究都定義為刑事犯罪。2004年，中國科技部和原衛生部聯合頒布的《人胚胎干細胞研究倫理指導原則》中，也明確了14天準則的限制。

很長一段時間，科學家們只能實現人類胚胎在受精后6-7天的體外培養，但隨著研究的不斷進步，時間的限制已經在被不斷地突破。

2016年，美國科學家阿里·布里凡（Ali Brivanlou）和英國科學家瑪格達萊娜（Magdalena Zernicka-Goetz）分別在《自然》(Nature)和《自然細胞生物學》（Nature Cell Biology）發表研究成果，實現了人胚胎受精后13天的培養，逼近14天的期限。

為規避進一步研究的倫理限制，譚韜等人團隊、王紅梅等人團隊研究靈長類胚胎的體外培養體系，并同時于2019年11月在《科學》（Science）雜志發文，表明實現了食蟹猴胚胎體外20天的培養。

2022年，譚韜、季維智在《科學與社會》期刊發文提問：“這些研究表明，人類胚胎體外培養超過14天，完全理解人類原腸運動機制是有可能的。在前沿科學研究和人類健康的需求推動下，‘14天倫理準則’是不是必須繼續嚴格遵守、保持不變？”

高紹榮向澎湃科技表示，“全世界很多科學家都在討論‘14天倫理準則’是否需要改變這件事，但改變并不容易。目前‘14天倫理準則’是否進行修改由各國各自把握，中國還沒有修改，各個國家也還沒有制定相關的規制，還需要更多討論?！?/p>

2021年，國際干細胞研究學會發布的干細胞研究及其向醫學轉化應用的最新指南建議：“考慮到人胚胎培養取得的進展，以及這類研究具有創造促進人類生命健康和福祉的有益知識的潛力，14天后胚胎的研究如果在某個國家（或地區）獲得廣泛的公眾支持，并且地方政策和法規允許的話，可以開展相關研究。”

譚韜和季維智認為，相關的倫理規制存在一定的滯后。“這種倫理規制的滯后將會影響我國在此方面的創新發展和生命科學的前沿領域取得新的突破，為解決不孕不育和發育疾病服務。是時候重新評估14天的限制，對14天后人胚胎研究制定新的倫理規制?！?/p>