·“早期器官的形成和發(fā)育是發(fā)育生物學(xué)中一個比較重要的階段，但這是一個‘黑匣子’，大家對它都不了解，兩個研究團隊通過體外培養(yǎng)來模擬胚胎在體內(nèi)的發(fā)育，但和體內(nèi)（胚胎發(fā)育）是否完全一樣，有待進一步研究。”

當(dāng)?shù)貢r間5月11日，《細胞》（Cell）雜志刊登了兩篇背靠背論文，兩個研究團隊通過各自的創(chuàng)新性平臺將非人靈長類胚胎的體外培養(yǎng)延長至25天，重現(xiàn)并系統(tǒng)研究了靈長類胚胎早期發(fā)育階段的多個重要事件。

據(jù)悉，早期胚胎發(fā)育異常與出生缺陷直接相關(guān)，研究早期胚胎發(fā)育過程、探究發(fā)育機理，有助于揭示病理性胚胎發(fā)生機制，提升相關(guān)疾病診療效率。有數(shù)據(jù)顯示，目前已知的出生缺陷病種超過8000種，中國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，每30秒鐘就會有一名缺陷兒出生。

“這兩項工作最主要的貢獻是把靈長類胚胎體外培養(yǎng)的時間延長至25天。這兩個團隊之前也發(fā)表過論文，將靈長類胚胎的體外培養(yǎng)時間延長到20天，這次又延長了5天，這樣就可以看到原腸運動和早期器官分化等胚胎早期發(fā)育階段的重要事件。” 5月13日，同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院院長、長期從事胚胎發(fā)育與體細胞重編程的表觀調(diào)控機制以及干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的高紹榮教授向澎湃科技表示。

“早期器官的形成和發(fā)育是發(fā)育生物學(xué)中一個比較重要的階段，但這是一個‘黑匣子’，大家對它都不了解，兩個研究團隊通過體外培養(yǎng)來模擬胚胎在體內(nèi)的發(fā)育，但和體內(nèi)（胚胎發(fā)育）是否完全一樣，有待進一步研究。”高紹榮說。

據(jù)悉，人早期胚胎發(fā)育起始于受精卵（胚胎期第0天）。受精卵經(jīng)過數(shù)次卵裂形成囊胚，囊胚于胚胎期第7天左右種植入母體子宮并進一步發(fā)育，于胚胎期第14天啟動原腸運動。原腸運動是早期胚胎發(fā)育過程中的里程碑事件，在此過程中，胚胎細胞發(fā)生大規(guī)模分化、遷移和重排，并形成外、中、內(nèi)三胚層和體軸。

外胚層于胚胎期第20天左右進一步發(fā)育形成位于中間的神經(jīng)板（也稱為神經(jīng)外胚層，neural plate or neural ectoderm）、位于兩側(cè)的表皮外胚層（surface ectoderm）和位于兩者之間的神經(jīng)板邊緣（neural plate border）。神經(jīng)板彎曲、折疊、增厚并進一步閉合，形成神經(jīng)管（neural tube）。閉合的神經(jīng)管沿胚胎背腹軸分化出不同的神經(jīng)祖細胞。神經(jīng)管形成的過程稱為神經(jīng)胚形成（neurulation）。中、內(nèi)胚層則進一步發(fā)育出體節(jié)、心臟、腸管等早期器官的原基，胚胎自此進入更加復(fù)雜的器官發(fā)育階段。

由于人早期胚胎樣品極難獲取，以上事件在人類胚胎中無法被直接探究和揭示。過去，研究人員已通過體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)初步揭示了人胚胎期第14天之前的發(fā)育事件，但14天后的發(fā)育事件則無從知曉，因為人類胚胎體外研究須遵循必須在胚胎期14天前終止的倫理規(guī)則。因此，研究人員轉(zhuǎn)而使用與人類進化和發(fā)育生物學(xué)特征高度相似的靈長類胚胎來替代人類胚胎，搭建非人靈長類胚胎體外培養(yǎng)體系，以理解早期胚胎發(fā)育調(diào)控機制。

猴胚體外培養(yǎng)延長至25天

第一篇論文由省部共建非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點實驗室、昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院譚韜、陳永昌、季維智團隊，以及中國人民解放軍總醫(yī)院、血液與健康全國重點實驗室劉兵團隊及德州西南醫(yī)學(xué)中心（University of Texas, Southwestern Medical Center at Dallas, UTSW）吳軍團隊合作完成，題為《從囊胚到早期器官形成的子宮外猴胚培養(yǎng)》（Ex utero monkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis）。該團隊開發(fā)了一種3D培養(yǎng)系統(tǒng)——優(yōu)化猴子宮外培養(yǎng)（Enhanced Monkey Ex Utero Culture , EMEUC），實現(xiàn)了食蟹猴胚胎體外25天的長時程培養(yǎng)。利用該平臺，研究人員系統(tǒng)研究了原腸運動及造血等早期組織器官發(fā)生的譜系特化軌跡和分子演進規(guī)律。

譚韜等人論文截圖。

在這項研究中，譚韜等人的團隊首先優(yōu)化了前期食蟹猴胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)，借助細胞外基質(zhì)構(gòu)建了3D培養(yǎng)環(huán)境，同時借助葡萄糖的加入，促進了胚胎體外發(fā)育，培養(yǎng)胚胎在形態(tài)、發(fā)育進程等與體內(nèi)胚胎高度一致，大約對應(yīng)體內(nèi)的卡內(nèi)基階段（carnegie stage）8c。

借助這一優(yōu)化的3D培養(yǎng)體系，譚韜等人觀察到早期胚胎發(fā)育過程的多個關(guān)鍵事件。他們發(fā)現(xiàn)EMEUC培養(yǎng)的胚胎除了早期神經(jīng)分化，還出現(xiàn)了造血譜系特化，體外胚胎的造血譜系特化高度模擬了體內(nèi)卵黃囊的兩個波次造血發(fā)生，研究團隊捕獲并識別了猴第一波次造血的關(guān)鍵前體細胞（包括生血成血管細胞、第一波次造血祖細胞），這也是迄今為止研究人員首次在非人靈長類胚胎中精確識別和系統(tǒng)解析到它們。此外，與以往的人多能干細胞的體外分化體系相比，體外培養(yǎng)的猴胚能夠產(chǎn)生更接近人體內(nèi)第二波次造血的生血內(nèi)皮細胞，表明該體系有望成為更合適的靈長類早期造血的研究模型。

除了外胚層和中胚層的譜系特化外，譚韜等人團隊還觀察到內(nèi)胚層的特化，在體外培養(yǎng)猴胚胎中發(fā)現(xiàn)了早期腸（primitive gut）的形成, 其與體內(nèi)猴胚胎及人胚胎腸亞群高度一致。進一步的研究揭示了分別與前腸和后腸形成相關(guān)的信號通路，并提出內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞參與了前、后腸發(fā)育過程。

第二篇論文來自中國科學(xué)院動物研究所的王紅梅研究員、郭帆研究員、李偉研究員和美國賓夕法尼亞大學(xué)(University of Pennsylvania) 尼古拉斯·普拉切塔（Nicolas Plachta）教授，題為《3D培養(yǎng)體系獲得食蟹猴早期神經(jīng)胚胎形成的過程》（Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture）。研究者建立了一個可支持食蟹猴胚胎體外發(fā)育至受精后25天的3D長時程培養(yǎng)體系，并基于該體系探究了靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經(jīng)發(fā)育過程中的核心事件和譜系特征。

王紅梅等人論文截圖。

在這項研究中，王紅梅等人的團隊首先比較了人類和非人靈長類胚胎2D和3D體外培養(yǎng)體系中胚胎的大小和存活率，發(fā)現(xiàn)2D和3D培養(yǎng)體系都能支持胚胎發(fā)育至胚胎期第20天。在2D體系下，胚胎由于胚外組織發(fā)育旺盛而迅速增大，但內(nèi)部的胚體發(fā)育并不好。而在3D體系下，胚胎的胚外組織生長受限，但胚體結(jié)構(gòu)顯著發(fā)育。為了保證胚體的發(fā)育，研究者繼續(xù)優(yōu)化3D體系，優(yōu)化后的體系能支持33.7%的食蟹猴胚胎發(fā)育到胚胎期第25天，該體系被命名為3D長時程培養(yǎng)體系（prolonged in vitro culture，pIVC）。

借助pIVC系統(tǒng)，王紅梅等人團隊確認體外胚胎重現(xiàn)了早期神經(jīng)胚胎形成的多個關(guān)鍵過程，包括神經(jīng)嵴形成與特化、神經(jīng)管閉合、神經(jīng)前體細胞的區(qū)域化、神經(jīng)前體細胞分化形成神經(jīng)元的過程等。

pIVC胚胎神經(jīng)管細胞的特化。 中科院動物所 供圖

此外，王紅梅等人還通過單細胞多組學(xué)測序技術(shù)，對9個pIVC胚胎的3850個單細胞的轉(zhuǎn)錄組和1862個單細胞的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性進行測序和分析，結(jié)果證實了體外培養(yǎng)的胚胎形成了內(nèi)、中、外三個胚層，包括原始生殖細胞，并且建立了晚期原腸運動階段的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性特征。

據(jù)《自然》報道，英國劍橋大學(xué)（the University of Cambridge）發(fā)育生物學(xué)家娜奧米·莫里斯（Naomi Moris）表示，這些研究在開發(fā)能比以前更長時間地維持子宮外胚胎的方法方面邁出了重要的一步。但她也提出了警示，“在實驗室培養(yǎng)的胚胎看起來和行為像真實的東西之前，還有很長的路要走。它們（體外培養(yǎng)的胚胎）看起來仍然與我們期望的略有不同。肯定還有改進的余地。”

“14天倫理準(zhǔn)則”是否可以改變？

人類胚胎發(fā)育研究一直遵循“14天倫理準(zhǔn)則” ，即在人類胚胎體外研究工作中，自受精之日起，人類胚胎體外培養(yǎng)的時間不得超過14天。

1978年，全球首例試管嬰兒的誕生引起了社會各界對胚胎體外培養(yǎng)的巨大關(guān)注。次年，美國道德咨詢委員會（Ethics Advisory Board）向美國衛(wèi)生教育與福利部（U.S. Department of Health, Education, and Welfare，HEW）提交了一份報告，首次明確了人胚胎體外培養(yǎng)的14天界限。隨后，英國政府召集了16位專家（包括醫(yī)生、科研人員等）組成“沃諾克委員會”（Warnock Committee），該委員會于1984年提出政策和立法建議：“由體外受精產(chǎn)生的人類胚胎，無論是冷凍狀態(tài)下或非冷凍狀態(tài)下，如果沒有進行胚胎移植，不能在體外存活至超過受精后第14天。”同時建議將超出期限的人類胚胎研究都定義為刑事犯罪。2004年，中國科技部和原衛(wèi)生部聯(lián)合頒布的《人胚胎干細胞研究倫理指導(dǎo)原則》中，也明確了14天準(zhǔn)則的限制。

很長一段時間，科學(xué)家們只能實現(xiàn)人類胚胎在受精后6-7天的體外培養(yǎng)，但隨著研究的不斷進步，時間的限制已經(jīng)在被不斷地突破。

2016年，美國科學(xué)家阿里·布里凡（Ali Brivanlou）和英國科學(xué)家瑪格達萊娜（Magdalena Zernicka-Goetz）分別在《自然》(Nature)和《自然細胞生物學(xué)》（Nature Cell Biology）發(fā)表研究成果，實現(xiàn)了人胚胎受精后13天的培養(yǎng)，逼近14天的期限。

為規(guī)避進一步研究的倫理限制，譚韜等人團隊、王紅梅等人團隊研究靈長類胚胎的體外培養(yǎng)體系，并同時于2019年11月在《科學(xué)》（Science）雜志發(fā)文，表明實現(xiàn)了食蟹猴胚胎體外20天的培養(yǎng)。

2022年，譚韜、季維智在《科學(xué)與社會》期刊發(fā)文提問：“這些研究表明，人類胚胎體外培養(yǎng)超過14天，完全理解人類原腸運動機制是有可能的。在前沿科學(xué)研究和人類健康的需求推動下，‘14天倫理準(zhǔn)則’是不是必須繼續(xù)嚴格遵守、保持不變？”

高紹榮向澎湃科技表示，“全世界很多科學(xué)家都在討論‘14天倫理準(zhǔn)則’是否需要改變這件事，但改變并不容易。目前‘14天倫理準(zhǔn)則’是否進行修改由各國各自把握，中國還沒有修改，各個國家也還沒有制定相關(guān)的規(guī)制，還需要更多討論。”

2021年，國際干細胞研究學(xué)會發(fā)布的干細胞研究及其向醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用的最新指南建議：“考慮到人胚胎培養(yǎng)取得的進展，以及這類研究具有創(chuàng)造促進人類生命健康和福祉的有益知識的潛力，14天后胚胎的研究如果在某個國家（或地區(qū)）獲得廣泛的公眾支持，并且地方政策和法規(guī)允許的話，可以開展相關(guān)研究。”

譚韜和季維智認為，相關(guān)的倫理規(guī)制存在一定的滯后。“這種倫理規(guī)制的滯后將會影響我國在此方面的創(chuàng)新發(fā)展和生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域取得新的突破，為解決不孕不育和發(fā)育疾病服務(wù)。是時候重新評估14天的限制，對14天后人胚胎研究制定新的倫理規(guī)制。”