·“基因編輯藥物從體外的細胞治療往直接體內治療過渡的過程中，對遞送載體提出了更高的要求，遞送載體成了體內基因編輯藥物臨床應用的關鍵限速步驟。”

·“這一系統在細胞靶向特異性方面展現出的出色效果令人振奮，但其遞送效率仍有一定的提升空間，體內遞送的長期安全性也需要更多更具說服力的研究數據支撐。”

當地時間3月29日，美國麻省理工學院—哈佛大學博德研究所（Broad Institute of MIT and Harvard）張鋒團隊在《自然》（Nature）雜志在線發表了題為《通過細菌收縮注射系統進行可編程蛋白質輸送》（Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system）的論文，他們通過AlphaFold輔助蛋白質設計開發了一種新的蛋白質遞送系統——改造、利用獨特的細菌“注射器”將蛋白質注射到人類細胞中。

張鋒團隊論文截圖。

以色列耶路撒冷希伯來大學（the Hebrew University of Jerusalem）的計算微生物學家阿薩夫·萊維（Asaf Levy）在接受《自然》采訪時表示，“這可能會對醫學產生變革性的影響，它可以設計有效載荷和特異性，這是非常酷的。”

上海科技大學生命科學與技術學院王皞鵬教授向澎湃科技表示，這項研究為蛋白質精準遞送技術的設計和開發提供了新方向，為將來在基因治療、癌癥治療、生物防治、核酸遞送等領域的應用奠定了技術基礎。但相關應用還需要進一步的研究和開發。

“張鋒團隊新開發的PVC遞送系統是團隊針對目前基因蛋白藥物遞送難題的一次出色探索，他們巧妙地把細菌注射系統和基因編輯器遞送相結合，開創了一個新的非病毒遞送方向。”華東師范大學生命科學學院研究員吳宇軒告訴澎湃科技,“這一系統在細胞靶向特異性方面展現出的出色效果令人振奮，但其遞送效率仍有一定的提升空間，體內遞送的長期安全性也需要更多更具說服力的研究數據支撐。而針對遞送效率、特異性、安全性等的充分研究是臨床應用前不可或缺的。”

精準、靈活的細菌“注射器”

內共生細菌是一類特殊的細菌，可以寄生在宿主細胞內部，它已經進化出復雜的遞送系統，使其能夠分泌調節宿主細胞的生物因子。細胞外收縮注射系統（eCIS）就是一個例子，它是一種類似注射器的大分子復合物，可以通過在細胞膜表面誘導出一個刺突蛋白，從而將攜帶的蛋白質有效載荷注入到真核細胞中。

2022年4月29日，中國醫學科學院病原生物學研究所微生物學家江峰團隊在《科學》（Science）雜志發表論文稱，他們可以在生物發光細菌Photorhabdus asymbiotica中操縱這種類似注射器的系統，將他們從哺乳動物、植物和真菌中選擇的蛋白質加載到注射器中。張鋒團隊在論文中提到，類似的發現提高了eCIS用于治療性蛋白質遞送的可能性，然而，這些遞送系統是否能在人類細胞中起作用，以及這些系統用來識別目標細胞的機制尚不清楚。

張鋒團隊選擇了來自Photorhabdus asymbiotica的eCIS——PVC（Photorhabdus virulence cassette ），他們發現，PVC有效載荷蛋白的N端高度無序區域是其“包裝結構域”，只要將其與想要遞送的蛋白融合，就能將其加載到PVC復合體中。隨后，他們利用預測蛋白質結構的人工智能程序AlphaFold設計了修改尾部纖維蛋白（PVC13）的方法，使其能夠精準地靶向人類細胞表面表達的不同蛋白。

PVC系統可以被重新編程以在真核細胞中定制蛋白質遞送。圖片來源：張鋒團隊論文

通過對eCIS的進一步改造，張鋒團隊可以使用這一系統遞送不同類型的蛋白載荷，他們已經在體外實驗中成功遞送了CRISPR基因編輯系統中的Cas9蛋白以及另一類用于基因編輯的鋅指蛋白。在小鼠的體內實驗中，這種經過改造的遞送系統也可以將蛋白遞送到小鼠大腦的神經元中。

這一PVC遞送系統將有哪些應用潛力？王皞鵬介紹，它可以應用于基因治療、癌癥治療、生物防治和核酸遞送四個方面。“雖然作者沒有在文中成功實現核酸的遞送，但是目前有研究利用病毒肽構建病毒樣顆粒實現核酸的遞送將病毒肽與DNA結合，然后將病毒肽包裹在PVC內，可能也可以利用PVC系統實現核酸遞送。”

具有高度靶標特異性，但效率有待提升

吳宇軒的研究方向之一是通過CRISPR基因編輯治療以地中海貧血為主的血液疾病。在美國哈佛大學從事博士后研究期間，他完成了基于CRISPR且不依賴于病毒遞送的血紅蛋白基因治療方法的臨床前研究。回國后，他領導完成了全球首個體外CRISPR基因編輯治療β珠蛋白完全缺失的β-地中海貧血的成功案例。

吳宇軒表示，張鋒團隊研發的PVC遞送系統表現出高度的靶標特異性，能有效地將載荷遞送到擁有特定表面受體的細胞中。尤其是在人和小鼠細胞的靶向特異性測試中，展現了接近100%的靶向特異性。另一方面，該系統的靶向特異性可以通過對尾部纖維蛋白的合理改造來實現，這表明PVC展現出的高特異性是便于改造和拓展的，這給利用該系統進行細胞或組織特異性的體內蛋白靶向遞送提供了廣闊的想象空間。

另一個優點是，該遞送系統具有良好的安全性基礎。“作者發現，PVC處理不會產生任何顯著的免疫細胞激活、炎性細胞因子的產生、體重減輕或細胞毒性，表明PVC處理在該實驗時間過程中沒有免疫原性或毒性。同時，顱內注射后，PVC在大腦中只是短暫存在，不會持續很長時間。” 吳宇軒解釋，“當然，長期的安全性仍然需要更多謹慎細致的研究才能確定，尤其是系統性給藥的免疫原性如何尚不明了。”

王皞鵬也向澎湃科技表示，在將這一系統應用于人類治療之前，需要解決的最主要問題之一是確保遞送系統在人體內的安全性和有效性。首先需要進行更多體內試驗，以了解其生物相容性和藥物代謝動力學，以及在不同的生物體內的生物分布和遞送效果。其次，需要進一步開發和優化PVC系統的設計，以提高其蛋白遞送效率和靶向準確性。

如果要實現在臨床上的廣泛應用，還應設計合理的生產工藝和流程以實現大規模生產PVC遞送系統，并確保其質量和純度。“因為PVC遞送系統源于發光桿菌的毒力基因簇，在人體內應用時具備免疫原性，可能會被人體免疫系統識別為外來抗原引發免疫應答，從而降低PVC遞送系統的效率。”王皞鵬說。

吳宇軒指出，這一遞送系統的遞送效率仍有待提升。“該研究中展示的基于PVC的遞送系統進行體外細胞系基因編輯的效率僅有12%左右，距離各種疾病使用基因編輯進行治療的效率閾值仍有差距。”

另一方面，如果要將該遞送技術應用于體內，考慮到遞送損耗以及體內細胞所處環境的復雜性，該遞送系統所產生的編輯效率可能會進一步下降。“與目前常用的AAV載體相比，基于PVC的遞送系統顆粒大小（約116nm）相較于前者（約25nm）較大，和納米脂質體顆粒（LNP，約60-200nm）大概相當。過大的包裝體積，可能給體內實質組織中的深層細胞的高效率遞送造成一定的困難。并且，基于本項和前人關于PVC系統的研究，我們推測，該系統的包裝遞送效率可能也會受到載荷蛋白大小的影響，這可能是該遞送系統針對體外細胞的編輯效率過低的一個可能的原因。”吳宇軒解釋，“現有的高效基因編輯工具相較于目前常用的遞送工具的有效容量來說普遍偏大，這對包括新開發的PVC系統等胞外壓縮注射系統仍然是一個暫未克服的挑戰。”

基因編輯知名科學家為何轉向遞送系統研究？

張鋒是基因編輯領域先驅科學家。2013年1月，張鋒團隊首次將CRISPR基因編輯技術應用于哺乳動物和人類細胞。2013年年底，張鋒及其他四位基因編輯先驅科學家合伙創立了基因編輯公司Editas Medicine，創始團隊包括2020年因開發基因編輯技術而獲得諾貝爾化學獎的詹妮弗杜德納（Jennifer Doudna），以及堿基編輯先驅劉如謙（David Liu）。

2023年2月，張鋒聯合創建的新銳基因編輯公司Aera Therapeutics完成了近2億美元融資，將進一步優化根據其實驗室研究開發的蛋白納米顆粒（PNP）遞送平臺技術。劉如謙的研究團隊也正在開發基于病毒樣顆粒（virus-like particles, VLP）的遞送工具。此外，還有多家新銳公司專注于開發創新載體。

吳宇軒也注意到了張鋒和劉如謙的動向。他認為，兩位基因編輯領域的知名科學家轉向遞送系統研究的一個重要原因是，基因編輯藥物從體外的細胞治療往直接體內治療過渡的過程中，對遞送載體提出了更高的要求，遞送載體成了體內基因編輯藥物臨床應用的關鍵限速步驟。

據王皞鵬介紹，目前針對遞送載體的研究主要集中于蛋白質遞送系統和核酸遞送系統。在蛋白質遞送系統方面，越來越多的研究聚焦于蛋白質遞送載體的優化和改造，也有研究探索新型蛋白質遞送系統。在核酸遞送系統方面，主要的方法又分為病毒載體和非病毒載體兩種。

吳宇軒解釋，相對成熟的病毒遞送系統，例如AAV，由于其在體內極長的表達時間，如若用于基因編輯器的遞送，有很大的安全隱患；而以LNP為主的非病毒遞送系統在mRNA遞送方面已經展現出了巨大的潛力，在肌肉注射（如mRNA疫苗）和肝臟遞送（如遞送基因編輯器mRNA的體內基因編輯藥物）等方面展示出了很好的成藥性以及出色的臨床結果，但是開發精準肝臟外靶向的非病毒遞送載體，治療例如神經系統疾病的新一代mRNA或者基因編輯藥物，仍然缺乏接近臨床轉化的重大突破。

張鋒在接受《自然》采訪時表達了相似的觀點。他認為，遞送系統的限制是基因編輯的主要瓶頸之一，大多數臨床試驗只能編輯肝臟、眼睛或血細胞的基因組，因為這些實驗使用目前的遞送方法完成。“我們沒有看到大腦或腎臟疾病得到解決，是因為沒有良好的遞送系統。”

參考資料：

1.https://www.nature.com/articles/d41586-023-00922-4#ref-CR1

2.https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

3.https://mp.weixin.qq.com/s/VbH8_Dz_ajZUkdn_8qOvfw