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《自然》一日三文關注兒童不明原因肝炎，病毒載體AAV或“背鍋”？
“《自然》的文章通過與對照組的比較，提示AAV2感染的比例在患兒中顯著更高。這比以往僅僅是在患兒中檢測到某個病毒來說，證據強度高了很多。但這仍不能算直接的致病證據，屬于是提供了一個值得進一步探索的方向?！?/u>
“在之前的認知中，AAV是沒有毒性和致病性的一種安全性能很好的病毒載體用于基因治療，現在這些關于AAV導致肝炎的報道，勢必引起人們對其安全性的重新思考?！?/u>
當地時間3月30日，《自然》（Nature）雜志連續發表三項獨立研究，指出2022年以來的不明原因兒童肝炎病例的增加與2型腺相關病毒（AAV2）這種常見的兒童病毒有關。但三項研究均未明確AAV2究竟為肝炎的致病原因，還是僅僅是對另一種病毒感染的提示。
腺相關病毒（AAV）是一種細小單鏈DNA病毒，由于公認的安全無害而被廣泛用作基因治療的載體。AAV不能獨立復制，需要在輔助病毒，如皰疹病毒或腺病毒存在時，才能進行復制和感染。此前有研究表明，AAV的自然感染可發生在所有年齡段，在兒童1至5歲之間存在一個AAV2感染高峰。
病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟病變為主的一種傳染病，目前主要有甲、乙、丙、丁、戊五種病原學分型，除乙型肝炎病毒為DNA病毒外，其余均為RNA病毒。2022年以來，美國、英國等35個國家報告了1000多例病因不明的兒童急性重型肝炎聚集性病例，部分病例很嚴重，需進行肝臟移植，僅有少數病例有生命危險。
世界衛生組織（WHO）將在全球范圍內出現的不明原因兒童急性重癥肝炎定義為：自2022年1月1日起，患有急性肝炎（非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒引起），且天冬氨酸轉氨酶（AST）或丙氨酸轉氨酶（ALT）大于500IU/L的10歲及以下兒童。
兒童不明原因肝炎暴發引起廣泛關注。由于其出現在新冠大流行期間，一種說法認為，它們的出現與新冠病毒有關。更多專業人士認為，兒童不明原因肝炎和人腺病毒（HAdV）相關。HAdV，特別是HAdV-41，已在英國和美國的急性重癥肝炎病例聚集性血液中被發現。
HAdV是無包膜的雙鏈DNA病毒，能在成人和兒童中引起多種感染，包括呼吸器官感染、結膜炎和胃腸炎（引起感染的類型主要是HAdV-40和HAdV-41）。對免疫功能低下的患者來說，HAdV感染可能危及生命，但對于沒有潛在合并癥、免疫功能正常的兒童來說，HAdV感染引起肝炎是罕見的。
美國阿拉巴馬大學伯明翰分校（The University of Alabama at Birmingham）遺傳學博士周葉斌向澎湃科技表示，“《自然》的文章通過與對照組的比較，提示AAV2感染的比例在患兒中顯著更高。這比以往僅僅是在患兒中檢測到某個病毒來說，證據強度高了很多。但這仍不能算直接的致病證據，屬于是提供了一個值得進一步探索的方向?！?/p>
“那么多兒童肝炎病例中，很可能存在不同的致病機制，這些相關性研究很難單獨確證發病原因，如果有進一步的機理研究（如細胞實驗、動物模型）能證實AAV2與某些病毒共同感染，可以導致肝細胞損傷（或者再加上特殊的免疫背景），那么就離證實上述文章提出的假說更近了一步?！敝苋~斌說。
復旦大學生命科學學院青年研究員王鵬飛長期致力于艾滋病、新冠等傳染病的防治研究，他告訴澎湃科技，“去年（2022年）下半年就有聽說不明原因的兒童肝炎與AAV相關，但是AAV2是否是導致肝炎的直接或者主要原因？如果是，它導致肝炎的機制是什么？這些都是還沒有研究清楚的問題?，F在只是在病人體內發現了AAV，還需要做動物實驗去驗證AAV能導致肝炎?！?/p>
另一方面，王鵬飛提示，“在之前的認知中，AAV是沒有毒性和致病性的一種安全性能很好的病毒載體用于基因治療，現在這些關于AAV導致肝炎的報道，勢必引起人們對其安全性的重新思考?！?/p>
美國16例調查：AAV2與輔助病毒共同感染可能讓肝炎更嚴重
3月30日，美國加州大學舊金山分校（University of California, San Francisco）傳染病專家邱華彥（Charles Chiu）團隊在《自然》雜志在線發表題為《美國兒童急性重型肝炎中的2型腺相關病毒》（Adeno-associated virus type 2 in US children with acute severe hepatitis）的論文，揭示了兒童不明原因肝炎與AAV2及輔助病毒共同感染的相關性。
其團隊使用PCR監測、基于病毒富集的測序和宏基因組測序分析了2021年10月1日至2022年5月22日在美國的6個州（阿拉巴馬州、加利福尼亞州、佛羅里達州、伊利諾伊州、北卡羅來納州和南達科他州）登記的16名不明原因兒童急性重癥肝炎患者，以及113例對照樣本，包括42例（37%）非肝炎患者，30例（26.5%）明確病因的急性肝炎（ALT>100 U/L）患者，23例（21%）急性胃腸炎患者（12例HADV糞便檢測陽性）和18例（16%）獻血者。
在14例兒童不明原因急性重癥肝炎患者的血液中，93%（13/14）檢測到AAV2序列，并且在所有14例病例中均檢測到HAdV。而113例對照樣本中僅有4例（3.5%）檢測到AAV2。值得注意的是，對照組中30例明確病因的肝炎患者中未檢測到AAV2。
在14例兒童不明原因急性重癥肝炎病例中，12例（85.7%）檢測到EB病毒（EBV）、人類皰疹病毒6（HHV-6）或腸道病毒A71（EV-A71）的合并感染，對照組中，23例急性胃腸炎（無肝炎）患者中僅有3例（13.0%）合并感染AAV2，研究人員對此表示驚訝。進一步研究顯示，與對照組相比，AAV2、EBV和HHV-6與病例顯著相關。此外，在AAV2/HADV共感染的病例中，AAV2的病毒載量大約比HADV高了約12.7倍。邱華彥團隊表示，此前研究顯示，AAV可以抑制其他嗜肝病毒的復制，可部分解釋這一觀察結果。
病毒檢測和對照研究。圖片來源：邱華彥團隊論文
邱華彥團隊表示，他們的這些發現表明，AAV2和一種或多種嗜肝病毒病原體的合并感染與不明原因兒童急性重癥肝炎的臨床表現之間存在顯著關聯，但直接原因未得到證實。他們的研究結果還表明，與腺病毒或皰疹病毒單獨感染相比，與AAV2共感染可能導致更嚴重的肝臟疾病。
不過邱華彥團隊也指出，AAV2感染也可能是肝臟炎癥的標志物，并非致病原因，需要進一步的研究，如血清學監測、病毒培養和動物模型，以調查AAV2感染在不明原因兒童急性重癥肝炎中可能發揮的潛在作用。
英國格拉斯哥大學32例調查：或與AAV2和HLA等位基因相關
3月30日，英國格拉斯哥大學（University of Glasgow）病毒學家艾瑪·湯姆森（Emma Thomson）團隊在《自然》雜志在線發表了題為《兒童非甲-戊型肝炎的2型腺相關病毒感染》（Adeno-associated virus 2 infection in children with non-A-E hepatitis），報道了AAV2和II型人白細胞抗原（HLA）等位基因DRB1*04：01與不明原因兒童急性重癥肝炎暴發的相關性。
“與罕見的人白細胞抗原（HLA）基因型的相關性是很有啟發的發現。無論是AAV還是腺病毒，都是比較常見的病毒，可感染肝炎的兒童畢竟是極少數，特殊的HLA基因型可能會讓人體對某個病毒產生的免疫反應不同于大多數人，可能在這些肝炎的發病機制里起了作用?！敝苋~斌告訴澎湃科技。
湯姆森團隊招募了32名在2022年3月14日至8月20日期間到醫院就診的不明原因兒童急性重癥肝炎患者，并設置了4個對照組，其中第1組為13名年齡范圍在3-5歲的健康兒童的血清或血漿；第2組為12名年齡范圍在1-4歲的兒童的血清或血漿，經PCR證實為HADV感染，轉氨酶正常；第3組為33名年齡范圍在2-16歲的兒童，轉氨酶均升高，PCR檢測為陰性；第4組為2022年3月至4月期間與32名肝炎病例同時住院的16名10歲及以下蘇格蘭兒童的殘余血漿/血清。
通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），湯姆森團隊在32個肝炎病例中的26個里檢測出了AAV2（81%），而對照組中檢出AAV2的概率為5/74（7%）。
為研究某些兒童在遺傳上是否更加容易患不明原因急性重癥肝炎，湯姆森團隊對27例肝炎病例和64例蘇格蘭本地血小板單采供者的對照組進行了所有人類白細胞抗原（HLA，一種幫助免疫系統識別受感染細胞的分子）位點（HLA-A、B、C、DRB1、DRB3/4/5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1）的高分辨率基因分型，發現約25/27（92.6%）不明原因嚴重急性肝炎患兒攜帶HLA的一個特殊基因——DRB1*04：01，而對照組的這一比例為10/64（15.6%）。該結果證實了他們的假設，有些兒童可能在遺傳學上更容易患上某類肝炎。
湯姆森團隊還進行了原位雜交（ISH）獨立檢測，表明AAV2感染極有可能引發CD4+T輔助細胞介導的免疫反應，這與患病兒童中II類HLA DRB1*04：01等位基因的頻率顯著增加相一致。
湯姆森團隊認為，兒童不明原因嚴重急性肝炎可能與AAV2的原發感染有關，而不是與其被再次激活有關。湯姆森團隊也注意到了AAV2是HAdV感染的非致病性生物標志物的可能性，但她們認為可能性較小，“因為我們沒有在肝功能正常的HADV感染兒童對照組中檢測到AAV2?！?/p>
湯姆森團隊指出，還需要對AAV2傳播的季節性變化作進一步研究，以及需要更大規模的研究來證實不明原因兒童急性重癥肝炎與II型HLA等位基因DRB1*04：01的相關性。
英國倫敦大學學院38例調查：輔助病毒或促進AAV2復制，誘導免疫介導的肝臟損傷
3月30日，英國倫敦大學學院（University College London）病毒學家朱迪思·布魯爾（Judith Breuer）在《自然》雜志在線發表了題為《兒童不明原因急性肝炎的基因組學研究》（Genomic investigations of unexplained acute hepatitis in children）的論文，同樣報道了不明原因兒童急性重癥肝炎與AAV2的相關性，并檢測到低水平的人腺病毒和人乙型皰疹病毒6B（HHV-6B），他們認為這些病毒或促進了AAV2的復制，潛在誘導了免疫介導的肝臟損傷。
布魯爾團隊使用了基因組、轉錄組、蛋白質組和免疫組織化學的組合方法，首先對5例肝移植病例的肝活檢和5例非移植病例的全血進行了非靶向宏基因組和宏轉錄組測序，隨后又對38例英國兒童不明原因嚴重急性肝炎病例進行驗證性的PCR檢測，其對照組為66名年齡匹配的免疫活性對照受試者和21名免疫功能低下的對照受試者。
通過對5例接受肝移植的患者的冷凍移植肝組織樣本和5例非移植肝炎患者的6份血液樣本進行的宏基因組和宏轉錄組測序，布魯爾團隊在所有5例接受肝移植的樣本中均檢測到豐富的AAV2，在非肝移植的6份血液樣本的5份中檢測到豐富的AAV2。所有肝移植樣本中都存在較低水平的HHV-6B，非肝移植的6份血液樣本中則沒有。
在驗證性的PCR檢測中，布魯爾團隊對AAV2（28/38）、HAdV（31/38）和HHV-6B（23/38）進行了PCR檢測，最終在27/28例患者的肝臟、血液、血漿或糞便中檢測到高水平的AAV2 DNA，檢測到的腺病毒（HAdV）和人類皰疹病毒6B（HHV-6B）水平較低，HAdV陽性為23/31例，HHV-6B陽性為16/23例。相比之下，即使在嚴重免疫抑制的情況下，在患有HAdV的對照組兒童的血液或肝臟中也很少檢測到低滴度的AAV2。
PCR、宏基因組學和病毒WGS結果。圖片來源：布魯爾團隊論文
布魯爾團隊表示，盡管不明原因兒童肝炎的發病機制和AAV2在其中的作用仍有待確定，但她們的研究強烈表明這是一個免疫介導的過程。同時布魯爾團隊也指出，其研究有很多局限性，例如調查的病例數量很少，免疫功能低下對照組的年齡不完全匹配等。
與新冠相關？
三項研究均提及了不明原因兒童急性重癥肝炎與新冠的關聯。
由于檢測到多種病毒的共同感染，邱華彥團隊推測，“新冠大流行、學校和托兒所關閉兩年多以及與其他兒童的社會交往減少，可能產生了一群脆弱的幼兒，由于缺乏接觸，他們未能對常見病毒病原體產生廣泛的免疫力，從而更易受多種病毒感染，增加了出現更嚴重疾病的可能性。”
湯姆森團隊調查了不明原因兒童急性重癥肝炎病例與既往新冠感染相關的可能性。他們在論文中表示，新冠病毒（SARS-CoV-2）直接導致肝損傷是不太可能的，因為他們的肝炎病例很少（31例中只有3例）在入院時新冠病毒PCR檢測呈陽性，并且他們沒有通過PCR或測序在任何病例的臨床樣本（包括肝活檢）中鑒定出新冠病毒。但他們目前不能完全排除新冠后免疫介導的現象，例如與II型HLA的聯系。
他們認為，2022年AAV2相關兒童急性重癥肝炎暴發可能是新冠大流行的間接后果?！?020年，通過實施非藥物干預措施，包括物理距離和旅行限制，減少了新冠病毒的傳播，同時也導致常見人類病毒的傳播被阻斷，AAV2、HAdV和HHV6B的暴露模式改變了。一旦限制解除，遺傳易感兒童同時暴露于HAdV和AAV2的機會更高，從而產生更嚴重的疾病。”
布魯爾團隊也表示，雖然她們幾乎沒有發現新冠病毒直接導致不明原因兒童急性重癥肝炎暴發的證據，但她們的數據本身并不足以排除奧密克戎（Omicron）的影響。
在一篇同時發表于《自然》的“新聞與觀點”文章中，德國柏林夏里特醫學院（Charité – Universit?tsmedizin Berlin）肝病學和胃腸病學系主任弗蘭克·塔克（Frank Tacke）也分析了新冠疫情封控措施的部分影響，“2022年春季的肝炎暴發與全球放寬防疫措施同步發生，之后病例數迅速回落。因此，對暴發時間點的解釋可以是兒童在封鎖解除后突然接觸到了大量病毒，或是因為免疫系統缺乏訓練導致他們更容易感染本來無傷大雅的病毒?！?/p>
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