作為基因表達(dá)調(diào)控的核心，轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)染色質(zhì)重塑復(fù)合物剔除核小體暴露出啟動(dòng)子, 允許轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（preinitiation complex，PIC）的組裝， 在中介體（Mediator）的幫助下組裝成PIC-Mediator轉(zhuǎn)錄起始超級(jí)復(fù)合物。徐彥輝團(tuán)隊(duì)圍繞人源轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制研究取得了系列重要突破，部分成果入選2021年度中國(guó)生命科學(xué)十大進(jìn)展。

PIC-Mediator是轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的核心，基因表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子附近促進(jìn)PIC-Mediator的招募和組裝，而表觀遺傳對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控集中在啟動(dòng)子下游的第一個(gè)核小體上（稱為+1核小體）。與其他核小體不同，+1核小體含有組蛋白乙酰化和H3K4三甲基化修飾，特征性的組蛋白變體H2A.Z和H3.3。這些特征的形成受修飾酶和染色質(zhì)重塑復(fù)合物動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，影響所在基因的表達(dá)水平，是表觀遺傳調(diào)控的核心。目前絕大部分模型顯示轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與+1核小體是分離的，+1核小體中組蛋白的柔性末端修飾可結(jié)合TFIID幫助PIC招募，同時(shí)轉(zhuǎn)錄機(jī)器進(jìn)入延伸狀態(tài)才遇到并繞過(guò)+1核小體。以往所有轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)構(gòu)都是基于DNA模板，無(wú)法展示+1核小體與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之間的結(jié)構(gòu)功能關(guān)聯(lián)性。

2022年10月7日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院徐彥輝課題組在Science雜志上在線發(fā)表題為 “Structures of +1 nucleosome–bound PIC-Mediator complex ”的研究論文。該項(xiàng)研究解析了包含+1核小體的PIC-Mediator復(fù)合物結(jié)構(gòu)，首次展示了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與+1核小體的緊密結(jié)合，表明+1核小體對(duì)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物在染色質(zhì)上組裝的重要調(diào)控作用（圖1），建立了表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄起始的直接關(guān)聯(lián)。

結(jié)合+1核小體的PIC-Mediator結(jié)構(gòu)

以往的測(cè)序研究表明，多數(shù)+1核小體位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）下游約40 bp處。受這一現(xiàn)象啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了包含核小體和啟動(dòng)子的模板，根據(jù)核小體與TSS之間的距離，命名為T40N（T代表TSS，N代表核小體，數(shù)字代表距離），T50N，和T70N。利用體外重構(gòu)方法，成功組裝了分別結(jié)合三種+1核小體的PIC-Mediator轉(zhuǎn)錄起始超級(jí)復(fù)合物（84個(gè)蛋白，分子量4.3MD），通過(guò)結(jié)構(gòu)和生化分析，發(fā)現(xiàn)+1核小體與PIC-Mediator復(fù)合物存在多處直接相互作用及多種作用方式，通過(guò)結(jié)合 TFIIH和Mediator多個(gè)亞基，促進(jìn)PIC-Mediator在染色質(zhì)上的組裝和轉(zhuǎn)錄起始活性。

+1核小體與PIC-Mediator的結(jié)合還表現(xiàn)出與功能密切關(guān)聯(lián)的如下特點(diǎn)：

核小體位置的偏好性（圖2）。PIC-Mediator更傾向于結(jié)合T40N核小體，形成較為穩(wěn)定的相互作用。也可以結(jié)合T50N核小體，這時(shí)候會(huì)有一部分核小體趨向于解離，原因是核小體與復(fù)合物距離增加，結(jié)合要造成DNA的彎折產(chǎn)生張力部分抵消結(jié)合的吸引力。而到了T70N核小體，直接接觸就沒(méi)有了。體外轉(zhuǎn)錄起始活性實(shí)驗(yàn)顯示，T40N核小體可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，而T70N則沒(méi)有。這些結(jié)果不僅很好地解釋了體內(nèi)測(cè)序的結(jié)果（+1核小體與TSS距離40bp左右），也提示了其產(chǎn)生背后的原因。也就是說(shuō)，PIC-Mediator復(fù)合物要整合啟動(dòng)子上的序列信息與核小體的位置信息，決定其結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。人體中大部分啟動(dòng)子不含有TATA box這樣的強(qiáng)定位序列，PIC-Mediator是以+1核小體為主要的參考點(diǎn)，產(chǎn)生適宜的結(jié)合方式，這種結(jié)合的位置決定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

PIC-Mediator與三種不同定位核小體的結(jié)構(gòu)。A. T40N, T50N和T70N三種啟動(dòng)子模板的模式圖。B，C，D. 結(jié)合T40N，T50N，T70N的PIC-Mediator復(fù)合物結(jié)構(gòu)。E. T50N核小體（黃色）的四種不同結(jié)合狀態(tài)。

相互作用的包容性。核小體與PIC-Mediator通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，沒(méi)有明顯的序列特異性。比如TFIIH和Mediator亞基的堿性區(qū)，在整體復(fù)合物的框架下，結(jié)合核小體DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性表面。這種結(jié)合的特點(diǎn)是特異性低，只要電荷相反，位置臨近，就有吸引力。因此包容度高，可以允許一定程度的構(gòu)象變化及核小體的位置變化，使得轉(zhuǎn)錄機(jī)器能夠結(jié)合到各種不同啟動(dòng)子的核小體上。

目前主流觀念認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄機(jī)器在進(jìn)入到延伸階段才會(huì)碰到核小體，該項(xiàng)工作首次在分子水平上展示出了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與+1核小體的緊密結(jié)合，將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的表觀遺傳信號(hào)和轉(zhuǎn)錄起始建立了直接關(guān)聯(lián)。從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到+1核小體之間的幾十個(gè)核苷酸范圍內(nèi)（約14納米），發(fā)生的一系列轉(zhuǎn)錄起始事件（RNA合成，聚合酶前移，暫停，釋放，加帽，延伸等），數(shù)十種不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物（上百種蛋白）的動(dòng)態(tài)解離和結(jié)合，都需要考慮+1核小體及其表觀遺傳調(diào)控的影響（圖3）。這一研究將改變我們對(duì)轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程和以+1核小體為代表的染色質(zhì)相互關(guān)系的傳統(tǒng)看法，為研究表觀遺傳和基因表達(dá)調(diào)控提供新的指導(dǎo)框架和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

+1核小體在轉(zhuǎn)錄起始到轉(zhuǎn)錄早期延伸系列動(dòng)態(tài)過(guò)程中都可能發(fā)揮作用。從TSS到+1核小體為40bp左右，約為14nm，在這個(gè)范圍內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)錄早期事件，也是基因表達(dá)調(diào)控的核心區(qū)域。

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院青年研究員陳曦子、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院2020級(jí)博士生王鑫鑫、2019級(jí)直博生劉維達(dá)為本文共同第一作者，徐彥輝為通訊作者。

專家點(diǎn)評(píng)

李國(guó)紅 研究員（中科院生物物理所）

在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的精準(zhǔn)調(diào)控在許多重要生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。基因轉(zhuǎn)錄包括轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止三個(gè)過(guò)程，其中轉(zhuǎn)錄起始是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心，轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)。我們知道，真核生物中，基因組DNA纏繞組蛋白八聚體形成核小體，在連接組蛋白H1和其他染色質(zhì)架構(gòu)蛋白的作用下形成各種染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在基因轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。前期各種生物化學(xué)和基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子區(qū)域的核小體定位和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)具有非常鮮明的特征，比如啟動(dòng)子區(qū)域核小體被剔除或移位，形成一個(gè)開放的染色質(zhì)區(qū)域，這樣轉(zhuǎn)錄機(jī)器可以招募到啟動(dòng)子區(qū)域，并組裝形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。另外，非常有趣的是，在大多數(shù)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的第一個(gè)核小體（稱為+1核小體）定位非常有規(guī)律，一般位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）下游約40 bp處。并且，表觀遺傳組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)基因的+1核小體上富含各種重要的組蛋白化學(xué)修飾（比如H3K4me3和組蛋白乙酰化）和特異的組蛋白變體（H2A.Z和H3.3）。現(xiàn)在領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于+1核小體及其表觀遺傳特征在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控中的功能仍然不是很清楚，比如轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與+1核小體的相互作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制等。近年來(lái)，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，徐彥輝和Patrick Cramer等團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（PIC）和PIC-Mediator轉(zhuǎn)錄起始超級(jí)復(fù)合物的招募與組裝方面取得了一系列重要的突破性進(jìn)展和成果。但是，上述所有轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)構(gòu)都是基于裸露DNA模板，無(wú)法展示+1核小體與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之間的結(jié)構(gòu)功能關(guān)聯(lián)性。

徐彥輝團(tuán)隊(duì)今天在Science上發(fā)表的這項(xiàng)工作，正是回答了上述關(guān)鍵問(wèn)題。該項(xiàng)研究解析了包含+1核小體的PIC-Mediator復(fù)合物結(jié)構(gòu)，首次展示了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與+1核小體的緊密結(jié)合，表明+1核小體對(duì)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物在染色質(zhì)上組裝的重要調(diào)控作用，建立了表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄起始的直接關(guān)聯(lián)。該項(xiàng)工作實(shí)驗(yàn)體系復(fù)雜，難度非常大，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常巧妙，研究思路非常新穎。

1）研究團(tuán)隊(duì)為了證明+1核小體定位的重要功能，通過(guò)改變+1核小體與TSS之間的距離（40 bp, 50 bp 和70 bp），設(shè)計(jì)和構(gòu)建了三個(gè)不同DNA模板，這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)很巧妙，可以回答為什么一般+1核小體定位在TSS下游40 bp處。該研究結(jié)果顯示，+1核小體與PIC-Mediator的結(jié)合具有兩個(gè)顯著的特征：核小體位置的偏好性（～40 bp）和相互作用的包容性，很好解釋了PIC-Mediator復(fù)合物怎樣通過(guò)整合啟動(dòng)子上的序列信息與核小體的位置信息，決定其結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，精準(zhǔn)調(diào)控各種不同基因的轉(zhuǎn)錄起始。

2）利用體外重構(gòu)方法，研究團(tuán)隊(duì)成功組裝了分別結(jié)合三種+1核小體的PIC-Mediator轉(zhuǎn)錄起始超級(jí)復(fù)合物（84個(gè)蛋白，分子量4.3MD），并解析了它們的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。這個(gè)體系非常復(fù)雜，涉及蛋白質(zhì)種類多（包含近百個(gè)蛋白質(zhì)），結(jié)構(gòu)形式高度動(dòng)態(tài)，難度非常大。我本人在Danny Reinberg實(shí)驗(yàn)室做博士后期間做過(guò)類似的工作，我們利用體外轉(zhuǎn)錄體系，研究RNA Pol II在30-nm染色質(zhì)纖維上的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，深知這個(gè)體外重構(gòu)體系的難度和不容易。幾年前，在施揚(yáng)老師、石雨江老師和藍(lán)斐老師組織的表觀遺傳學(xué)retreat中，徐彥輝老師與本人有過(guò)深入交流，當(dāng)時(shí)我對(duì)利用冷凍電鏡解析轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程的調(diào)控機(jī)制還持懷疑態(tài)度。最近，徐彥輝團(tuán)隊(duì)和德國(guó)馬普所Patrick Cramer以及日本東京大學(xué)Hitoshi Kurumizaka等團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物招募與組裝以及RNA Pol II在核小體上轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制上取得了一系列突破性進(jìn)展。本人對(duì)徐彥輝老師團(tuán)隊(duì)取得的進(jìn)展和成果表示祝賀，也對(duì)完成這些工作的學(xué)生和工作人員表示敬佩，同時(shí)對(duì)我們自己研究工作也是一種極大的鼓勵(lì)。

3）在該項(xiàng)研究中，徐彥輝研究團(tuán)隊(duì)在+1核小體構(gòu)建了組蛋白變體H2A.Z核小體。在大多數(shù)高表達(dá)或可誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子下游+1核小體富含組蛋白變體H2A.Z，但是現(xiàn)在大家對(duì)H2A.Z核小體的生物學(xué)功能還有不少爭(zhēng)議。徐彥輝團(tuán)隊(duì)的該項(xiàng)工作顯示，TFIIH和Mediator亞基的堿性區(qū)可以與核小體DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性區(qū)域結(jié)合，H2A.Z核小體的酸性區(qū)域比常規(guī)核小體的酸性區(qū)域更酸，所以PIC-Mediator復(fù)合物與H2A.Z核小體的作用更強(qiáng)，這也許對(duì)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與+1核小體的功能互作具有重要意義。最近Patrick Cramer和Hitoshi Kurumizaka兩個(gè)團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡，解析了RNA Pol II轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合體（包含轉(zhuǎn)錄延伸因子DSIF（Spt4/5）、Spt6、PAF1、FACT (Spt16/SSRP1)和TFIIS）在核小體上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄延伸機(jī)制，捕獲到延伸復(fù)合體在核小體DNA上前進(jìn)的細(xì)節(jié)，發(fā)現(xiàn)延伸復(fù)合體可介導(dǎo)下游核小體解聚并在上游重新組裝，其中組蛋白伴侶FACT或Spt6促進(jìn)該過(guò)程，從而維持轉(zhuǎn)錄過(guò)程中核小體的完整性，這也驗(yàn)證我們研究團(tuán)隊(duì)幾年前FACT-核小體單分子磁鑷操縱的研究結(jié)果。值得一提的是，上述兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都是用常規(guī)H2A核小體來(lái)研究轉(zhuǎn)錄延伸機(jī)制，但是在大多數(shù)基因的+1核小體是H2A.Z核小體，未來(lái)利用冷凍電鏡和單分子技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物通過(guò)含有H2A.Z的+1核小體的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和動(dòng)力學(xué)過(guò)程將會(huì)更有生理學(xué)意義。

綜上所述，徐彥輝團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)工作實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)巧妙，實(shí)驗(yàn)體系復(fù)雜，難度大，內(nèi)容豐富，研究思路新穎，結(jié)構(gòu)非常漂亮。該項(xiàng)研究不僅改變了我們對(duì)轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程和以+1核小體為代表的染色質(zhì)相互關(guān)系的傳統(tǒng)看法，還為未來(lái)研究轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到+1核小體之間發(fā)生的一系列轉(zhuǎn)錄起始事件（RNA合成，聚合酶前移，轉(zhuǎn)錄停滯與釋放，RNA加帽和轉(zhuǎn)錄延伸等）的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供了研究體系和指導(dǎo)框架。在此，再次祝賀徐彥輝團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控機(jī)制研究方向上取得又一重要進(jìn)展，期待他們團(tuán)隊(duì)在后續(xù)研究中取得更多的突破。

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http://doi.org/10.1126/science.abn8131