16世紀后半期，天主教在日本發展勢頭迅猛。幾十位大名改宗天主教，吉利支丹信眾數十萬，不但遍及九州和本州南部，而且逐漸擴張到本州中部和東北。對耶穌會傳教的寬容政策，在織田信長死后，由豐臣秀吉繼續。1583年，他甚至親自在大坂劃出一塊土地給耶穌會，供建造教堂。日本關白和幾位耶穌會上層教士之間，也有不錯的私人關系。

然而，豐臣秀吉的態度，似乎在一夜之間發生轉變。這里的“一夜之間”并不是修辭。1587年7月23日，剛剛統一九州的豐臣秀吉來到博多地方，在一艘葡萄牙商船上，再次會見了耶穌會日本教區負責人科埃略神父（Gaspar Coelho）。賓主相談甚歡，豐臣再次允諾，在博多城賜給耶穌會一塊土地。科埃略則向豐臣贈送了葡萄牙的美酒。半夜，科埃略突然被豐臣的信使叫起來，要他立刻回答幾個咄咄逼人的問題：你們為什么要強迫他人改宗？為什么要搗毀佛教和神道寺院？為什么以馬、牛這樣有益的牲畜為食？為什么葡萄牙人要把日本人賣到海外為奴？

科埃略一頭霧水，不知所措地回應說，傳教士從不用暴力手段強迫日本人信教，除了偶爾吃牛肉外從不吃馬（以后可以連牛肉也不吃）。他還把搗毀佛神之事歸咎于天主教大名，并說耶穌會不支持葡萄牙商人的奴隸買賣。這些回應顯然沒什么用，豐臣的問題壓根不是質詢，而是斥責。

第二天，豐臣秀吉就下達了著名的《伴天連追放令》（“伴天連バテレン”是葡萄牙語“神父Padre”的日譯）。這份驅逐令起始便說，日本乃神國，而天主教則為邪教，命所有傳教士在20天內離境。但命令同時又說，葡萄牙人仍然可以來日本貿易。這道命令雖因實施困難，沒有嚴格奉行（歐洲傳教士們后來繼續在日本存在了很多年），卻是日本日后一系列禁教行動之始。

為什么天主教在日本的命運一夜逆轉？豐臣秀吉表面的理由——斥佛神、吃牛肉、販奴等等，當然都不是主因。據說那天夜里，親信施藥院全宗提醒他：天主教勢力日漸擴大，又有像高山右近這樣的實力大名擁護，早晚會成為威脅。驅逐令的文字，即出于曾為佛教徒、又是高山政敵的施藥院之手。

但豐臣的轉變，也不僅僅由于近臣間的內斗。實際上，豐臣對天主教的不信任早就有了，其猜忌正是來自于科埃略。一年前，科埃略在大坂拜見豐臣，豐臣向他透露攻打朝鮮和明朝之意，希望他能搞到兩艘葡萄牙戰船。作為回報，耶穌會可以在朝鮮和中國傳教。急于討好的科埃略不但一口答應，還吹噓說，他能夠調來印度的葡萄牙軍隊相助。

科埃略牛皮吹大，本是諂媚，但聽者有心。和織田信長一樣，豐臣秀吉對戰國時代日本佛院勢力介入政治十分敏感，他當然不希望天主教最后發展成新的政治宗派。在平定九州后，統一大業接近最終完成，此時的日本再也不是群龍無首，四散分裂。在權力逐漸重新集中之時，統一者格外提防禍起蕭墻。豐臣不但強化對各大名的控制，而且在全國下達刀狩令，禁止民間私藏武器。前面提到過，天主教在日本的擴展，其實得益于分裂：各大名相互競爭，將天主教和耶穌會視為葡萄牙帝國的代理人，才為傳教打開方便之門。正因此，耶穌會的早期成功也是其最大的隱患：因為很難和日本內外政治勢力撇開干系，又與海外貿易和武器直接掛鉤，它被視為威脅是很自然的事。總之科埃略的諂媚刺激了豐臣最敏感之處。

與此同時，耶穌會及葡萄牙在日本的成功，也引發西班牙和其支持的教團的覬覦。殖民菲律賓后，西班牙急切希望打開對日貿易。道明會、奧斯定會，特別是方濟各會，也謀求在日本擴大教團勢力。豐臣為開辟和馬尼拉的聯系，對代表菲律賓總督來訪的方濟各會傳教士頗為客氣。一時間，耶穌會和其他幾個教團相互抵牾，把歐洲和天主教內部的政治爭奪引入東瀛。

1596年10月，一艘從馬尼拉駛往墨西哥的商船圣菲利普號，被風暴吹到日本土佐。豐臣秀吉派人查扣商船并訊問船員。結果大嘴的船長在回答訊問時，夸耀西班牙在全球的殖民業績，并且透露說傳教士總是征服先導。這下，豐臣秀吉更加認定，天主教在日本傳播，背后是西班牙和葡萄牙對日本的殖民野心。他下令在京都和大坂逮捕了26名教士和信徒，并在翌年2月，以違背禁教令為名，將他們在基督教大本營——長崎公開處死。此次“長崎二十六人殉教事件”，揭開了日本大規模清洗、迫害天主教的序幕。

1598年，豐臣病死。經過一番權力重組，日本逐漸為德川家康收拾一統，于1603年開始了江戶幕府時代。仍然出于貿易考量，德川家康開始對天主教并未嚴格禁止，反而讓受西、葡兩國支持的天主教團獲得相對寬松的發展環境。但此時日本國內國際形勢，都和戰國時代完全不同了。

國內方面，德川家康一步步鞏固政權，不但排除政治異己，也強化對外貿易管理（如給從事外貿的商船頒特許朱印狀，并組織重要口岸商戶統一葡船生絲進價）。在此過程中，日本國內一些天主教大名及武士被排擠到對立面，使政治斗爭帶上了宗教色彩。意識形態領域，德川家康立儒家理學為正統，并逐漸恢復備受打擊的佛院勢力；同時儒、佛與神道之間亦有相互合流。這些對天主教來說都不是什么好消息。

國際方面，在西、葡之外，英國和荷蘭也打開了和日本的貿易通道。作為新興的新教國家，英、荷與西、葡在政治和貿易上敵對競爭。1600年，一艘荷蘭商船登陸日本，船上的英國人威廉?亞當斯因給幕府造船有功，成為德川的外交顧問，并被封為武士，賜名“三浦按針”。亞當斯告訴德川，除了天主教外，基督教內還有新教，新教國家并不熱衷傳教，宗教和貿易也是脫鉤的。而天主教國家往往通過傳教來征服別國。

在此情況下，日本執政者對天主教不再像以前那樣容忍甚至鼓勵，漸漸把介入政治過深的吉利支丹勢力視為安全隱患。幾次偶然性事件之后，幕府終于于1614年決心禁教，各地加快搜捕天主教傳教士和教徒，制造多起迫害事件。1620年，二代幕府德川秀忠當政期間，一艘帶有朱印狀的日本商船，在臺灣海域遭英荷聯合艦隊緝拿、貨品被沒收，雙方把官司打到長崎。本來是英荷在海上巧取豪奪，卻因日本商船內藏有兩位傳教士而演變成政治事件。結果1622年，船主平山常陳和傳教士慘遭火刑，船員被斬首。以“平山常陳”事件為導線，一個月后， 55名傳教士和教徒在長崎處死，史稱“元和大殉教”。

此后幕府的禁教愈加嚴苛，不但傳教非法，信眾也必須棄教。為了加強社會控制，幕府推行“寺請—檀家制度”，利用遍布各地的寺院，登記當地人口，監控地方社會。在天主教最早傳入、浸淫最長的南方，其影響很難在短期內消除。1637年，九州島原地區的民眾不堪領主的殘酷剝削，揭竿而起。“島原之亂”是江戶時代最大規模的農民起義。雖然不純由宗教而起，但因起事者多為吉利支丹、領袖亦以教為旗，使得這場變亂頗有宗教戰爭的性質。1638年，幕府征調十幾萬大軍鎮壓，約3.7萬名反抗者鮮有幸存。

這次大規模叛亂徹底地斷絕了天主教和幕府之間任何緩和余地。自此，幕府禁教更為決絕。與此配合的，是前后一系列斷絕與西班牙和葡萄牙往來、禁止日本人私自出海的政策。1644年，在羅馬加入耶穌會并獲得神父職位的小西曼施歐（天主教大名小西行長的外孫）被捕殉教，自此日本再無神父，由彌次郎和沙勿略帶來的日本“天主教世紀”正式結束。內心不愿棄教的教徒只能轉入地下，在與天主教世界隔絕的兩個多世紀里，秘密傳遞先輩的信仰，直到明治維新時代。