撰稿 | 楊暐健 （加州大學(xué)戴維斯分校 助理教授）

說明 | 本文由論文作者（課題組）撰稿

大腦是我們最重要也是最神奇的器官。隨著年齡的增大，人們患腦疾病的風(fēng)險急劇增加。對大腦的深入認(rèn)知不僅有助于研發(fā)治療腦疾病的藥物和方案，也可以啟發(fā)新的人工智能技術(shù)。作為研究大腦的重要工具之一，如何對大腦活動進(jìn)行高精度記錄和調(diào)控成為近年來的研究熱點。

美國加州大學(xué)戴維斯分校的楊暐健博士致力于研制先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)，并對活體小鼠腦神經(jīng)活動進(jìn)行高精度的記錄和調(diào)控。他于2021年獲得美國科學(xué)雜志和北京品馳醫(yī)療公司聯(lián)合創(chuàng)辦的Science & PINS神經(jīng)調(diào)控獎（獎項介紹>>>），以表彰他在雙光子三維全息光遺傳學(xué)的貢獻(xiàn)，并于2021年8月6日以唯一作者身份在《Science》發(fā)表了題為 Manipulating neuronal circuits, in concert 的文章。

圖源：《science》

經(jīng)Light學(xué)術(shù)出版中心（關(guān)于我們>>>）邀請，本文，楊暐健博士將介紹他近期的工作進(jìn)展，并重點介紹雙光子全息光遺傳學(xué)技術(shù)，以及它在神經(jīng)科學(xué)的應(yīng)用。

光遺傳學(xué)（名詞解釋>>>）是一種新興的神經(jīng)活動調(diào)控技術(shù)。通過基因改造技術(shù)，研究者們可以在特定類型的神經(jīng)細(xì)胞上表達(dá)對光敏感的離子通道（名詞解釋>>>）。當(dāng)受到特定波長光照射的時候，這些離子通道可以被打開，從而激發(fā)或者抑制神經(jīng)活動。

相比利用藥物對神經(jīng)活動進(jìn)行調(diào)控，光遺傳學(xué)具有優(yōu)異的時空特定性。而相比傳統(tǒng)的插入式電極刺激，光遺傳學(xué)能夠?qū)μ囟愋偷纳窠?jīng)細(xì)胞進(jìn)行非侵入式的刺激。基于這些優(yōu)點，光遺傳學(xué)備受神經(jīng)科學(xué)研究者們的青睞，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路和腦疾病的研究中。

雖然對不同類型的細(xì)胞具有特異性，光遺傳學(xué)卻不一定能夠?qū)儆谕活愋偷募?xì)胞進(jìn)行有選擇性的刺激。當(dāng)使用藍(lán)光或綠光激發(fā)時，目標(biāo)腦區(qū)中的很大一個三維區(qū)域都會被照射到，從而刺激到在該區(qū)域內(nèi)所有屬于某一特定類型的神經(jīng)細(xì)胞。

由于這些細(xì)胞可能具有不同的功能，如果它們被無差異地刺激，研究者們將很難對神經(jīng)環(huán)路的響應(yīng)進(jìn)行研究。為了實現(xiàn)高精度調(diào)控，我們有必要把光精準(zhǔn)地投射到由研究者設(shè)定的目標(biāo)細(xì)胞上，而非一整個區(qū)域。根據(jù)不同的應(yīng)用需求，目標(biāo)細(xì)胞可以是單一細(xì)胞，也可以是分布在三維神經(jīng)環(huán)路中的一群指定細(xì)胞。這種在三維空間中可編輯的激發(fā)方式是傳統(tǒng)顯微鏡無法實現(xiàn)的。

雙光子全息顯微鏡可以克服上述這一難關(guān)。這里涉及兩個技術(shù)。

第一，雙光子激發(fā)（名詞解釋>>>）。它具有光學(xué)切片（名詞解釋>>>）能力：由于雙光子的激發(fā)效率和光強(qiáng)的平方成正比，這使得雙光子激發(fā)效率在聚焦區(qū)域達(dá)到頂峰，而在聚焦區(qū)域之外迅速減弱。同時，雙光子激發(fā)使用近紅外光，在生物樣品中的光散射較弱，可以高質(zhì)量地聚焦到樣品比較深的區(qū)域。

第二，光全息技術(shù)（名詞解釋>>>）。通過一個空間光調(diào)制器（名詞解釋>>>），光全息技術(shù)可以把激發(fā)光分解并聚焦到三維空間中的多個區(qū)域。把雙光子激發(fā)和光全息技術(shù)結(jié)合起來，就可以同時對分布在三維空間中的多個目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行刺激，而不直接影響到它們周圍的細(xì)胞。通過快速切換光全息圖，不同的目標(biāo)細(xì)胞群可以依次被刺激到。所以雙光子全息顯微鏡同時具有很高的空間和時間分辨率。

圖：通過空間光調(diào)制器構(gòu)建三維全息投射。[W. Yang, et. al, Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current Opinion in Neurobiology 50, 211-221 (2018)]

圖：雙光子全息顯微鏡在熒光樣品中的三維投射例子。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

楊暐健博士及其合作者是最早把雙光子全息光遺傳學(xué)應(yīng)用到活體小鼠大腦中，實現(xiàn)對在三維空間中的一組神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行刺激，并同時記錄其活動的團(tuán)隊之一。在此之前，雙光子全息光遺傳學(xué)僅僅被應(yīng)用在小鼠大腦切片中，又或是活體小鼠大腦的單一切面中。

楊暐健博士將此技術(shù)推廣到三維大腦空間，他的雙光子顯微鏡有兩大特點：

1. 該顯微鏡擁有兩個光路，把雙光子三維高速鈣離子成像（名詞解釋>>>）和雙光子三維全息光遺傳學(xué)結(jié)合起來，實現(xiàn)對神經(jīng)活動的同時讀寫。其中一個光路實現(xiàn)鈣離子成像，對神經(jīng)活動進(jìn)行記錄。另外一個光路實現(xiàn)全息光遺傳學(xué)，對神經(jīng)活動進(jìn)行調(diào)控。通過在鈣離子成像光路中設(shè)置一個電調(diào)焦透鏡，顯微鏡可以高速記錄在不同深度的神經(jīng)細(xì)胞活動。通過這一神經(jīng)活動圖，研究者們可以選定目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞，并把它們的空間位置編碼到空間光調(diào)制器中，從而在樣品中生成三維全息投射并刺激目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞。為了避免“讀”和“寫”的相互串?dāng)_，兩光路使用不同波長的光，可以獨立激發(fā)對應(yīng)的鈣離子探針和光敏離子通道。

2. 該顯微鏡可以同時刺激多個神經(jīng)細(xì)胞，但又要避免使用過高的激光能量而在大腦中產(chǎn)生過多熱量。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，該顯微鏡使用低重復(fù)頻率的飛秒激光器作為光遺傳學(xué)的雙光子光源。相比在雙光子顯微鏡中普遍使用的高重復(fù)頻率飛秒激光器，低重復(fù)頻率飛秒激光器有很高的單脈沖能量，從而在保持低平均功率的情況下大大提高了雙光子激發(fā)效率。利用這一優(yōu)點，該顯微鏡可以用比較低的激光功率同時刺激近百個神經(jīng)細(xì)胞。

圖：通過雙光路顯微鏡對小鼠大腦神經(jīng)活動的高精度記錄和調(diào)控。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

雙光子全息光遺傳學(xué)可以把信息精確地寫入大腦中，這為調(diào)控大腦活動和動物行為提供了一個有力工具。在2019年《Cell》的一篇論文中，楊暐健博士及其合作者證實了對小鼠視覺皮層神經(jīng)細(xì)胞的精確調(diào)控可以模擬小鼠的視覺感知，并觸發(fā)其行為。換句話說，視覺信息無須通過眼睛進(jìn)入大腦，而可以被雙光子全息光源直接寫入到大腦，使小鼠 “感知” 到真的視覺刺激。除此以外，雙光子全息光遺傳學(xué)還可以對大腦進(jìn)行編程。多個實驗室證實，如果在激發(fā)一組大腦神經(jīng)細(xì)胞的同時給予小鼠獎勵，那么小鼠可以學(xué)會把這組神經(jīng)細(xì)胞的活動和獎勵聯(lián)系起來。這相當(dāng)于人工建立了一個神經(jīng)活動和動物行為的新鏈接。

正如楊暐健博士在其《Science》的獲獎?wù)撐闹刑峒埃?strong>雙光子全息顯微鏡把光遺傳學(xué)帶入到一個嶄新的精準(zhǔn)時代。展望未來，雙光子全息光遺傳學(xué)將繼續(xù)在基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)中發(fā)揮重大作用，也有望在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中大展身手。

論文信息

Yang W, Carrillo-Reid L, Bando Y, Peterka DS, Yuste R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018).

https://doi.org/10.7554/eLife.32671

Yang W, Yuste R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current opinion in neurobiology 50, 211-221 (2018).

https://doi.org/10.1016/j.conb.2018.03.006

Carrillo-Reid L, Han S, Yang W, Akrouh A, Yuste R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell 178, 447-457.e5 (2019).

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.045

Yang W, Manipulating neuronal circuits, in concert. Science 373, abj5260 (2021).

https://doi.org/10.1126/science.abj5260

編輯 | 趙陽

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