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2020年11月24日，來自中國科學院動物研究所劉光慧課題組、曲靜課題組以及中國科學院北京基因組研究所張維綺課題組在Cell Press細胞出版社旗下期刊Developmental Cell聯合發表了名為“A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging”的研究論文，首次繪制出了人類皮膚衰老的單細胞轉錄組圖譜，系統地揭示了皮膚衰老過程中細胞類型特異性轉錄網絡的變化。

機體衰老，是每個人隨著年齡增長都不可避免的過程，其中皮膚變化是最明顯的衰老跡象之一。進入中年以后，我們的皮膚逐漸松弛，面部開始出現皺紋。盡管已有研究指出皮膚衰老是由于彈性組織的損失和皮層變薄，但從微觀角度，由于皮膚各類細胞的高度特異性，傳統方法難以準確揭示這一現象背后的細胞特異性分子及其作用機制，這阻礙了我們對皮膚衰老的理解及對于相關疾病的干預。

▲圖1. 人皮膚衰老的單細胞轉錄組圖譜研究

本文研究策略及結果概要

我們的皮膚由三層結構組成：表皮，真皮和皮下組織。最外面的表皮起到抵抗外部環境的物理屏障的作用，其主要由角質形成細胞構成，其可進一步分為：基底細胞（BC），棘細胞（SC）和顆粒細胞（GC）。此外，表皮還包含能夠抵抗紫外線的黑素細胞和能介導外來病原體免疫識別的朗格漢細胞（LC）。相比之下，真皮中充滿了維持皮膚強度和彈性的細胞外基質（ECM）和真皮成纖維細胞、免疫細胞和內皮細胞。在表皮和真皮之間是對細胞間通訊和黏連至關重要的真皮-表皮連接層（DEJ）。介于皮膚不同類型細胞的高度異質性和動態性，傳統的RNA測序（RNA-seq）往往只能提供細胞和組織基因表達的總體或平均水平，難以真正揭示出皮膚衰老的相關機制，而單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術的出現則為從單細胞水平探索皮膚生理和病理情況下轉錄組的變化提供了前所未有的機會。

在本研究中，研究人員獲得了一組來自不同年齡段健康女性的眼瞼皮膚樣品，將其分為三組：青年（Y）、中年（M）和老年組（O），并比較了各組之間的形態學以及各類型細胞的基因表達模式差異。

單細胞轉錄組分析鑒定出皮膚中不同細胞類型及其分布隨年齡的變化

對于樣品的形態學分析顯示，表皮厚度、真皮-表皮連接層的卷積和膠原蛋白密度在皮膚衰老過程中不斷降低，并且各類型細胞的細胞密度也隨著增齡而有所下降。為了在單細胞水平研究皮膚衰老過程中細胞類型特異性基因的表達變化，研究人員利用scRNA-seq和生物信息學分析，根據不同細胞特定標志物的表達規律識別了11種細胞類型，包括基底細胞、有絲分裂細胞、黑素細胞、棘細胞、顆粒細胞、內皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞等，對于每類細胞標記基因的分析顯示出其獨特的轉錄特征和與其物理功能相關的富集通路。

▲圖2. 利用scRNA-seq分析鑒定不同年齡段皮膚中細胞的類型

單細胞分辨率下不同類型細胞中基因表達水平在皮膚衰老過程中的變化

為了在單細胞水平上探究皮膚衰老的機制，研究人員從三組樣本中鑒定了數千個差異表達的基因（DEG）。除了DEG數據顯示出的不同基因表達的上調或下調，研究人員還注意到，中年組在轉錄組水平上更接近老年組，表明在中年時皮膚已經進入衰老的早期。GO富集分析顯示，在不同類型細胞中，主要與炎性反應、氧化應激和細胞凋亡相關的基因隨年齡增長被上調，而主要與上皮細胞增殖和DNA修復有關的基因隨著年齡增長被下調。這些結果表明，在老年組的皮膚中發生了一系列以炎癥反應、光損傷和上皮維持障礙為特征的細胞類型特異性分子變化，并且可能導致皮膚對于與衰老相關皮膚疾病的敏感性增加。

表皮與真皮中不同細胞亞群關鍵基因表達水平的改變

接下來本研究分別探究了表皮和真皮中不同種類細胞的基因表達水平變化。在表皮中，由于基底層細胞能夠通過不斷增殖分化來維持皮膚屏障的穩定和更新，因此研究人員著重探索了基底細胞的異質性。表皮基底細胞被分為六個亞群，每個亞群中與年齡相關的DEG通過層次聚類被確定。研究人員發現許多DEG在各亞群中是共享的。例如，在衰老過程中，炎癥因子IFI27在6個亞群的表皮基底細胞中普遍上調；衰老細胞的分子標記物CDKN1A在三個亞群中上調，而屏障功能相關基因在衰老過程中在三種以上的基底細胞亞群中下調，此外，重要的皮膚發育基因KLF5和KLF6也有不同程度的下調，而KLF6的下調導致促炎因子表達上調以及細胞增殖能力下降。這些數據表明，與增齡相關的關鍵轉錄因子的減少可能是表皮自我更新衰退和衰老的重要因素。

在真皮中，本研究選取了對于傷口愈合至關重要的成纖維細胞，并通過特征基因進一步定義了成纖維細胞的亞群。研究發現，在所有11種皮膚細胞類型中，成纖維細胞具有最高水平的衰老相關轉錄變異性。與表皮基底細胞相似，隨著皮膚衰老，成纖維細胞中炎性因子表達上調，而涉及細胞增殖、DNA損傷修復相關的基因表達則被下調，其中包括核心調節性轉錄因子HES1在內的多種轉錄因子是下調最多的基因。通過對于表達下調最為嚴重的轉錄因子的進一步實驗揭示了HES1的下調是成纖維細胞衰老的潛在驅動因素，而內源激活或過表達HES1則有助于細胞增殖和抑制細胞衰老。此外，本研究還發現通過補充一種稱為槲皮素的化合物，可以延緩紫外線照射后的或缺乏HES1的皮膚成纖維細胞的衰老，從而為干預和減緩皮膚衰老提供了新策略。

小結

綜上，本研究利用scRNA-seq確定了不同類型細胞中獨特的基因表達特征以及隨著年齡增長各個基因表達水平的變化，從而描繪出了一幅全面的人類皮膚衰老過程轉錄組圖譜，為理解皮膚衰老和治療相關疾病提供了新的思路。

作者專訪

Cell Press細胞出版社特別邀請論文通訊作者劉光慧研究員代表團隊進行了專訪，請他為大家進一步詳細解讀。

CellPress：與傳統RNA測序技術相比，本研究采用的主要技術單細胞RNA測序的優勢有哪些？

劉光慧研究員：傳統的RNA測序方法（Bulk RNA-sequencing）檢測的是一塊組織的成千上萬個細胞，得到的是這些細胞內基因的平均轉錄本水平。而皮膚組織中包含多種細胞類型，理論上每一種細胞類型在衰老過程中的基因表達變化都有可能不同，這是傳統RNA測序方法無法檢測到的。單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing）技術可以發現皮膚中新的細胞類型或細胞亞型，因而能揭示衰老過程中細胞群體組成的變化，同時檢測到每種（每個）細胞內隨衰老發生的基因表達變化，進而可以闡明細胞類型特異的基因表達變化規律，這是單細胞RNA測序方法的優勢所在。

CellPress：本研究鑒定出了人類眼部皮膚各細胞亞群在衰老過程中關鍵因子表達水平發生的變化，首次描繪出了人類眼部皮膚衰老的單細胞轉錄組圖譜。這對于今后的衰老問題研究將帶來何種啟示/影響？可能會有哪些應用？

劉光慧研究員：皮膚是人體與外界的第一道防線，被認為是最先出現衰老表征的組織之一。其中，眼部皮膚的衰老一直受到人們的廣泛關注。我們通過單細胞測序和基因調控網絡分析發現，隨著年齡的增長，關鍵轉錄因子KLF6和HES1在特定皮膚細胞類型中的下調表達，是引發皮膚衰老的關鍵驅動因素。同時，我們的研究也發現，天然植物化合物槲皮素可以延緩人真皮成纖維細胞的衰老。希望這項研究可以為深入揭示人類皮膚衰老的機制提供參考數據，更希望能為皮膚衰老的干預提供新的線索和思路。

CellPress：您團隊在本研究中遇到的最大困難是什么？是如何克服的？

劉光慧研究員：衰老研究的挑戰之一是器官衰老的異質性。皮膚是很復雜的組織體系，細胞類型異質性高。經過一段時間的條件摸索，我們優化了皮膚組織的單細胞分離方法，最大程度地保持了分離所得細胞的活力?；趩渭毎麥y序結果，我們鑒定出了涵蓋真皮層及表皮層的11種細胞類型，其中表皮層的基底細胞又可以進一步細分為6種不同的亞群。我們對這些皮膚細胞類型和亞群在衰老過程中的細胞比例以及基因表達變化情況都進行了細致的分析。同時，我們對從年輕、中年和年老個體皮膚獲得的數據進行了整合分析，確定了皮膚衰老的關鍵時間節點，進而鑒定出隨著衰老發生變化的基因表達模式。通過分析，我們發現中年組與老年組的皮膚相較于年輕組具有更為相似的轉錄組特征，這提示中年人眼部皮膚細胞內的基因表達已經呈現出明顯的“衰老”特征，因此，中年時期可能是皮膚退行性演變的重要時間節點。此外，還有一個科學問題是，能否找到導致皮膚衰老的關鍵驅動力？通過對衰老相關差異基因調控網絡的分析，我們預測了數個可能調控皮膚衰老的轉錄因子。進而通過在相應原代皮膚細胞中進行基因敲減或基因激活，我們最終揭示了上述兩個核心轉錄因子KLF6和HES1在調控人類皮膚衰老中的核心作用。

CellPress：衰老一直是研究人員關注和公眾關心的焦點話題，那么您團隊下一步有什么計劃？是否會針對這些表達水平變化進行進一步研究？

劉光慧研究員：人類衰老研究領域一直存在著三個基本的科學問題：（1）我們究竟有多老？（2）我們為什么會老？（3）我們能否老得慢些？第一個問題涉及到衰老程度的科學評估，第二個問題涉及衰老發生的機制，第三個問題則是指衰老的干預。考慮到靈長類器官和組織衰老的異質性及復雜性，開展單細胞組學研究是回答上述三個問題的關鍵途徑。例如，單細胞測序中發現的差異表達基因可以用作評價皮膚衰老的新型生物學標記物，皮膚衰老過程中失活的核心轉錄因子可能成為提高皮膚活力的分子靶標，而對這些轉錄因子的重新激活（如通過基因治療手段或尋找相關小分子化合物）則可能為延緩皮膚衰老提供新策略。

作者團隊簡介

劉光慧研究員

劉光慧，中國科學院動物研究所研究員，膜生物學國家重點實驗室副主任，中國科學院干細胞與再生醫學創新研究院副院長，主持國家自然科學基金委杰出青年基金，創新群體等項目?，F任國際健康與壽命研究學會（Academy for Health & Lifespan Research, AHLR）共同創始人/科學理事，中國細胞生物學學會衰老細胞生物學分會（CSACR）會長，Protein & Cell副主編，Stem Cell Research & Therapy副主編，Cell Reports編委，Aging Cell編委。獲中國青年科技獎特別獎，談家楨生命科學創新獎，中國科學院杰出科技成就獎，顧孝誠講座獎，藥明康德生命化學研究獎，首屆老年醫學杰出貢獻獎等榮譽。

曲靜研究員

曲靜，中國科學院動物研究所研究員，中國科學院大學存濟醫學院教授。主持國家重點研發計劃，國家自然科學基金委重大研究計劃重點，優秀青年基金等項目。現任Cell Proliferation，Mechanisms of Ageing and Development及Zoological Research編委會成員。獲中國科學院大學朱李月華優秀教師獎，中國科學院杰出科技成就獎，中國細胞生物學學會干細胞分會青年研究員獎等榮譽。

張維綺研究員

張維綺，中國科學院北京基因組研究所（國家生物信息中心）研究員，博士生導師。致力于衰老機制與干預研究，已發表（共同）第一/通訊作者論文30余篇，主持國家自然科學基金委優秀青年基金等項目，現任中國細胞生物學學會干細胞生物學分會和衰老細胞生物學分會委員。

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